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考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量 实验目的 掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理和方法。学习分光光度计的原理及使用方法。 实验原理 实验步骤 试剂 试管编号 0 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白质溶液/ml 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 样品0.1 样品0.1 相当于蛋白质含量/微克 0.00 20 40 60 80 100 未知 未知 蒸馏水/ml 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 0 考马斯亮蓝染液/ml 3 3 3 3 3 3 3 3 打开分光光度计，预热30min。 取8支洁净的干燥试管，按上表进行编号，0~5号用于标准曲线的绘制，6号、7号用于样品溶液的测定。 取微量注射器，用蒸馏水清洗3次，再用标准蛋白质溶液润洗2次。按上表在0~5号试管中加入标准蛋白质溶液，然后用蒸馏水洗3次，再按上表在0~5号试管中加入相应含量的蒸馏水。 微量注射器用样品润洗2次，抽取100微克的样品加入到6号试管，再抽取100微克加到7号试管。用蒸馏水清洗微量注射器。 取5ml的移液管，用蒸馏水清洗3次，用考马斯亮蓝染液润洗2次。在0~7号试管中各加入3.0ml的考马斯亮蓝染液。振荡试管，混合均匀。 待其充分反应（约2分钟）后，用分光光度计分别测它的吸光值。 用0~5号的数据。以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 由样品液的吸光值查标准曲线求出蛋白质含量。 实验结果与分析 试管编号 0 1 2 3 4 5 6 7 A595 0 0.383 0.603 0.871 1.093 1.189 0.876 0.836 样品溶液吸光值 （0.876+0.836）/2 0.856 查标准曲线得样品液的蛋白质含量为66.0微克 分析： 考马斯亮蓝G-250能与蛋白质结合，染液与蛋白质结合后引起染料最大吸收峰的改变，从464nm变为595nm，光吸收值增加。同时蛋白质——染料复合物具有高的消光系数，大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1微克蛋白质。染料与蛋白质结合迅速约2min，结合物的颜色在1h内保持稳定。一些阳离子如K+,Na+,Mg2+以及（NH4）2SO4，乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如T-ritonX-100,SDS等则严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。 优点：染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高。 缺点：每次测量都得重新绘制标准曲线。 注意事项： 1、每次测量吸收值都应用0号试管中的溶液去校准，以免后面的结果偏差过大。 2、0号试管起空白对照的作用，消除一定的系统误差。 3、6、7号实验的关键，它们之间的吸收值应非常接近，误差保持在10%的范围内。如果误差超过这个范围，则实验宣告失败。