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高效液相色谱仪使用中常见问题及对策 高效液相色谱（HPLC）作为一种分离技术和方法，目前已经发展到一个全新的阶段。高精度的输液泵，应用广泛的色谱分离柱，低噪音、高灵敏度的各种检测器和功能强大的数据处理软件系统的出现，都推动了液相色谱技术的迅猛发展。液相色谱仪正以它分辨率高、分析速度快和应用广泛的优点倍受仪器分析工作者的青睐，广泛地应用于医药卫生、环境监测、食品检测等领域。作者本人从事液相色谱分析工作二十多年，应用HPLC技术在血药浓度、生物胺、核苷酸、蛋白质浓度测定等实际工作中，积累了许多的方法和经验，在这里与大家交流，希望能对同行们有所帮助和借鉴，共同促进液相色谱分析技术的发展。1　高效液相色谱仪的基本工作原理　　高效液相色谱仪如图1所示，是由溶液贮器、高压泵、进样系统、色谱分离柱、检测器和数据处理系统几部分组成。 高压泵从溶液贮器中抽走流动相，流经整个仪器系统，形成密闭的液体流路。样品通过进样系统注入色谱分离柱，在柱内进行分离。柱流出液进入检测器，使已被分离的组分逐一被检测器收集，并将响应值转变为电信号后经放大被数据处理系统记录色谱峰，通过数据处理系统对记录的峰值进行存储和计算[1]。　　液相色谱仪是依靠色谱柱进行分离的。研究证明：物质的色谱过程是指物质分子在相对运动的两相（液相和固相）中分配“平衡”的过程。液相色谱是以具有吸附性质的硅胶颗粒为固定相，各种洗脱液为流动相。当液体样品在载体流动相的推动下，在液-固两相间作相对运动时，由于各组分在两相中的分配系数（K）不同，则使各自的移动速度不同，即产生差速迁移。各组分在两相间经过多次分配，从而达到使混合物分离的目的。 上式反映了物质在两相中进行吸附、解吸、再吸附、再解吸…过程中，由于在两相中浓度的不同，而存在分配系数上的差异。　　既然分配系数及其差异是引起组分在液相色谱柱分离的根本原因，那么，必然地也会同色谱理论中可测宏观量之间存在着某种定量关系，事实上，色谱理论中通常用容量因子k’的概念来反映物质在两相中的分配关系： k’值可以非常方便地表达组分在两相的分配，又很容易从色谱实验数据中直接测得，是色谱理论中重要的基本参数之一[2]。2　输液泵的常见故障及对策　　 输液泵/高压泵是保证HPLC系统流路畅通、流量精确和压力稳定的重要仪器部件，目前多用往复式恒流柱塞泵，主要由柱塞杆、密封垫圈和两个单向阀组成，用马达带动凸轮驱动柱塞杆作吸液和排液的往复运动。常分为单柱塞泵、并联柱塞泵、串联柱塞泵和柱塞隔膜泵等类型。流动相混合方式分为低压混合和高压混合。常见泵的故障主要有以下几种，并提供解决的办法。2．1　单向阀故障? 由于球与阀座密封不严，液体倒流，造成压力不稳，甚至球与阀座粘在一起阻死。密封不严主要是污染或气泡引起，球与阀座粘连也是由于污染和磨损造成。　　 为避免单向阀中的宝石球和阀座被污染，流动相应使用HPLC级的溶剂，并且配好的流动相一定要用0．45u滤膜过滤和脱气。如果泵被微粒污染，可分别用水、甲醇、异丙醇、二氯甲烷依次冲洗。冲洗时应打开泄液阀，最后再用所用的溶液冲洗整个系统。　　 气泡进入阀中会紧贴在阀体的一侧，使宝石球难返回到阀座，引起倒流，泵的压力和流速会明显改变。此时，应立即打开泄液阀，大流量（2ml/min）冲洗泵，直至排除液为直线型。因为甲醇可润湿泵内壁，挤出气泡，故也可使用脱过气的甲醇冲洗泵。长期不用的泵或新装的泵头应该用甲醇赶气泡。泵进气泡也可在泵头上排气泡，即用扳手固定住进气泡的泵头，拧开输出管道的压帽，手动泵送液，可见到气泡从孔中挤压出来，直至无气泡排出将压帽拧紧[3]。　　 采取上述办法仍不能使压力稳定，应考虑是否密封垫坏了？或单向阀磨损、球不光滑等，需更换部件。2．2　泵垫圈故障　泵垫圈常见的故障是渗漏和垫圈受损污染系统。液相色谱系统一般情况下不要使用强酸强碱溶液，因为这会损坏密封垫和柱塞杆。密封垫圈与运动着的柱塞杆紧密接触，可使柱塞在泵头自由运动而流动相不漏出来，它是液相色谱系统中最易磨损的部件。有条件的实验室可三个月更换一次垫圈，防止泵系统污染。如果用缓冲盐作流动相则更会加速垫圈的磨损，应及时冲洗。当垫圈损坏时，表现为：泵压力不稳、泵头漏液。一旦出现这个现象，应尽快更换新垫圈。　　 为避免上述故障的发生，我们在分析工作中应注意以下几点： 使用超纯水（18MΩ．cm）、纯度级别较高的试剂和色谱级溶剂配制流动相； 配好的流动相一定要抽滤脱气，即便仪器有在线脱气装置，也最好在上机前进行抽滤。真空抽滤既过滤颗粒也脱了气泡，非常有效。 泵在起动前一定要通过泄液阀抽净泵里的空气。 用缓冲盐洗脱时，分析结束后一定要用水冲洗泵和整个流路系统，不要让腐蚀性溶液滞留泵中，最后用有机溶剂充满系统。3　色谱分离柱的使用与维护　　 在前述仪器工