RNA抽提与反转录步骤x.docVIP

RNA抽提步骤 准备： DEPC水配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置后备用。配成终浓度为0.1%，室温搅拌过夜，121℃高压20min，4℃密封保存。注：DEPC属于一种致癌物质，易挥发，要小心并在通风橱中操作，高压后就会分解，其毒力消失。 加Trizon裂解细胞：加入适当量的Trizol至细胞中（直接加入去培养液平板中后用枪吸出，亦可细胞刮下后离心去上清再加，用量约1ml Trizol每3×106、cells）。贴壁细胞在遗弃培养基后，可以直接加入Trizol（按10cm2 / 1ml Trizol的比例）裂解，匀浆一定要彻底。反复吹打以打碎细胞结块，室温放置5min，使其充分裂解。（注：此时可以-80℃长期保存） 4度，12000g×5min离心弃沉淀。 萃取除杂蛋白：加入0.2体积的氯仿，立即剧烈摇动充分混匀。混匀后冰上放置15min。(注：禁用漩涡震荡器，以免基因组DNA断裂，造成基因组DNA污染) 4℃，12000g，离心15min，此时溶液分为三层：下层的酚-氯仿，白色浑浊的中间相多为变性蛋白，水相（RNA所在相），小心吸取水相（宁可损失，也不要吸到中间相），转移至另一干净RNaseFree EP管中；一般水相的体积为Trizol的60℅. 异丙醇沉淀：向水相中加入0.5倍体积（相对于Trizol）的异丙醇，充分混匀，混匀后置于-20℃1~2h或-80℃30min，4℃，12000g，离心5-10min；（经过此步可在管底看到白色RNA沉淀）；如果起始量大的话，可以加入异丙醇即可观察到微量浑浊，则可直接离心。弃上清，RNA沉于管底。移去上清。 75%乙醇（DEPC水配制）漂洗：加入0.5-1ml 75%乙醇（让75%乙醇从沉淀上缓缓流过，温和震荡离心管，悬浮沉淀，7500g 5min（转速太大可能会使RNA断裂）吸去乙醇，然后用枪吸沉淀附近乙醇，再短暂离心后小心吸出剩余的液体。 溶解RNA沉淀：用50ul DEPC水或0.5%SDS溶解RNA样品，55—60℃加热5—10min。 去除二级结构：将RNA放置65℃水浴锅5min（去除二级结构）后，迅速放至冰上（防止RNA恢复原有结构）； 测浓度、260/280,260/230 检测RNA抽提效果：1% Agarose Gel,220V（用大电流跑迅速跑完防止RNA电泳过程中降解）,待溴酚蓝跑完全胶的三分之一时，停止电泳观察结果。见下图1。 RNA保存：-80℃可长年保存（尽量避免放置在4℃，-20℃冰箱） 图1：RNA抽提结果。亮度一般28S18S5S,如果5S rRNA条带过亮，则说明RNA有降解。注：电泳取样量为3μl. RNA反转录步骤 取总RNA 2μg，加入10mM dNTP，OligodT（0.5μg/μl）各1μl； 70度加热5min，冰上放置2min； 在同一管中加入10(Buffer 2μl，RNase抑制剂1μl，反转录酶（50unit/μl）1μl。 轻轻混匀后置于42℃，60分钟。然后置80℃，5分钟。 RNA 2μg 10mM dNTP 1μL OligodT（0.5μg/μl） 1μL 1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置后备用。rizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于western blotting。 核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50μg/ml，μg/ml，单链寡核苷酸