基因工程的基本条件载体系统.ppt

争花不待叶， 密缀欲无条。 傍沼人窥鉴， 惊鱼水溅桥。;基 因 工 程;C 用于基因转移的受体菌或细胞;第二节 基因工程的载体系统;(一)载体的功能及特征;载体应具备的基本特性：;(二)质粒载体(Plasmid);2. 质粒的分类;3. 质粒的基本特性;（1）自主复制;;按复制能力可将质粒分为两种类型：;（2）质粒的不相容性;质粒的接合转移;性须;质粒的迁移作用（Mobilization)：非接合型的质粒 由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因， 因而不能自我转移。但如果在其寄主细胞中存在着一 种接合型的质粒，它们通常也是可以被转移的。这种 由共存的接合型的质粒引发的非接合型质粒的转移过 程，如ColE1质粒。;（4）编码性状;4. 质粒载体的构建;目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由 少数几个野生型质粒构建的。;多克隆位点(Multiple Cloning Sites, MCS);标记基因(Marker Gene);选择标记基因;筛选标记基因;?互补;lacZ’;宿主细胞可编码LacZ酶C端部分序列。虽然宿主 和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融 为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象 叫?互补(?-complement)。;当外源片段插入到质粒的多克隆位点后，产生无?互补能力的氨基端片段，因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。;;人工构建的质粒类型： ;整合质粒：装有整合促进基因及位点，便于外源 基因的整合；;;5. 重要的大肠杆菌质粒载体;pBR322： ;pUC18/19： ;pGEM-3Z/4Z：;6. 质粒DNA的分离与纯化;proteins;;;(三) ?噬菌体载体(? Bacteriophage);噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能 被开发成为基因工程的有用载体，因为：;;;λ噬菌体生物学特性：感染周期;;λ噬菌体生物学特性：溶原状态;2.λ-DNA载体的构建;根据切除的多少，可将λ-DNA分成两大类载体： ;插入型载体;（51 – 26Kb）;删除重复的酶切位点;加装选择标记;;加装选择标记 lacZ;Spi-正选择型载体;构建琥珀密码子的突变体 ;3.λ-DNA重组分子的体外包装;λ-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞；;?噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定 限度的，控制在野生型?-DNA长度的75%-105%之间。 在这一范围内的DNA可被包装成有活性的?噬菌体颗 粒，而超出了这个范围的就不能形成正常大小的噬 菌斑。;λ噬菌体载体属于克隆载体，主要用于克隆DNA 片段。构建cDNA文库和基因组文库,并从中筛选目 标基因是λ噬菌体载体一般用途，也可用于亚克 隆在大容量载体（如粘粒）中增殖的外源DNA片段。 ;5.λ-DNA及其重组分子的分离纯化;6.λ-DNA作为载体的优点;2700个外壳蛋白分子;+DNA;III VI I IV II X V VII IX VIII;;II;(五)考斯质粒和噬菌粒;pHC79;2.考斯质粒的特点;;;pUC118 pUC18 + M13间隔区 IG;pUC118/pUC119噬菌粒载体的优点：;pBluescript ：体外转录载体;pBluescript phagemid的结构特征：;（六）人造染色体载体;1.细菌人造染色体 （Bacterial Artificial Chromosomes BAC）;URA3;二、表达载体;作为表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求。即能将外源基因运载到受体细胞中，其基本骨架是最简单的质粒克隆载体中的复制起点和抗生素抗性基因；;（一）启动子(Promoters) ;启动子的筛选;启动子最佳距离的探测;启动子的构建;启动子的可控性;Plac;色氨酸启动子Ptrp的可控性：;l噬菌体启动子PlL的可控性：;（二）终止子(terminator);如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功 能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶 在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导 致重组质粒的不稳定性；;2. 强终止子的选择与使用;（三）核糖体结合位点(ribosome binding site);1. 核糖体结合位点的四个特征结构要素结构;2. 核糖体结合位点对外源基因表达的影响;SD序列与起始密码子之间的序列的影响：;SD序列与起始密码子之间的距离的影响：;起始密码子及其后续若干密码子的影响：;(四) 密码子(codon);生物基因组中的碱基含量：在富含AT的生物（如单链DNA噬菌 体fX174）基因组中,密码子第三位上的U和A出现的频率较高;而 在G