细胞沉默调节蛋白1(sirt1)活性荧光定量检测试剂盒（中文版.docVIP

PAGE  PAGE 4 细胞沉默调节蛋白1 （SIRT1）活性荧光定量检测试剂盒（中文版） 主要用途 细胞沉默调节蛋白1 （SIRT1）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过荧光探针氨甲基香豆素标记人工合成的乙酰化p53多肽底物，经过SIRT1脱乙酰基后，被位点特异性氨基肽酶水解，释放黄色对硝基苯胺，即采用荧光法来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、核蛋白样品、部分或完全纯化酶样品中SIRT1的活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。 技术背景 人体组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylase；HDAC）家属分成三类共20多个蛋白：种类I（class I）与酵母Rpd3蛋白同源，包括HDAC1、2、3、8，存在于细胞核中；种类II（class II）与酵母Hda1蛋白同源，包括HDAC4、5、6、7、9a、9b、10和HDRP/MITR，存在于细胞核和细胞浆里；上述两大种类的蛋白分子催化结构域含有锌，且曲古菌素A（trichostatin A；TSA）敏感。种类III（class III）为NAD+辅助因子必需，又称为sirtuins，与酵母Sir2（Silent Information Regulator 2）同源，包括SIRT1至7等，为曲古菌素A（trichostatin A；TSA）不敏感型赖氨酸脱乙酰基酶（lysyl-deacetylase）。催化赖氨酸脱乙酰基反应，以及由NAD+和乙酰（acetyl）基团转化产生的烟酰胺（nicotinamide）和O-乙酰ADP核糖（O-acetyl-ADP-ribose）。SIRT1位于细胞核内，与酵母Sir2同源性最高。其功能在于调节p53活性和抑制细胞凋亡。基于人工合成的乙酰化p53（379至382氨基酸位点）多肽底物Ac-Arg—His-Lys-Lys（Ac）具有抗氨基肽酶切离的功能，首先使用荧光染料氨甲基香豆素（aminomethylcoumarin；AMC）来标记乙酰化p53多肽底物，其次进行脱乙酰化，最后底物进一步在氨基肽酶的催化酶解，释放出具有强烈荧光的7-氨-4甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin；AMC）（激发波长350-360nm；散发波长450-465nm），由此来定量测定沉默调节蛋白1的活性。其反应系统为： 产品内容 裂解液（Reagent A） 毫升 分离液（Reagent B） 毫升 清理液（Reagent C） 毫升 萃取液（Reagent D） 毫升 缓冲液（Reagent E） 毫升 底物液（Reagent F） 微升 终止液（Reagent G） 微升 酶解液（Reagent H） 微升 补充液（Reagent I） 微升 标准液（Reagent J） 微升 产品说明书 1份 保存方式 保存 缓冲液（Reagent E）、 底物液（Reagent F）、 终止液（Reagent G）、 酶解液（Reagent H）和 标准液（Reagent J）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里； 底物液（Reagent D）和 标准液（Reagent J）避免光照，有效保证6月 用户自备 磷酸盐缓冲溶液（PBS）：用于清洗细胞样品 15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器 1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器 （微型）台式离心机：用于细胞预处理 培养箱：用于反应物孵育 酶标板或比色皿：用于反应和荧光分析的容器 荧光酶标仪或荧光分光光度仪：用于荧光分析 实验步骤 实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。 一、样品准备 准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 107细胞） 小心抽去培养液 小心加入10毫升用户自备的磷酸盐缓冲溶液（PBS），覆盖生长表面 小心抽去清理液 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化） 加入xx毫升 裂解液（Reagent A），混匀细胞 移入到预冷的15毫升锥形离心管 强力涡旋震荡10秒 置于冰槽里孵育15分钟 加入xx毫升预冷的 分离液（Reagent B），混匀 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1300g 小心抽