光谱检测技术在生命科学中的应用.ppt

第 2章 光谱检测技术在生命科学中的应用;;紫外线;主要部件紫外灯管和滤光片 波长254nm、302nm、365nm或2个、3个波长组合一体 用于检测凝胶和膜上紫外线激发的荧光染料EB、Sybr-Green等;可见光;主要部件日光灯管和磨砂玻璃 波长可见光 用于检测凝胶和膜上的染料硝酸银、考马斯亮蓝等及放射自显影胶片;主要部件 光学系统（光源、滤光片、光电倍增管） 机械运动和定位系统（步进马达） 自动控制系统 数据处理和传输系统 波长：340-700nm 用于各种微孔板检测 ;Elx-800酶标仪工作原理;;Elx-808酶标仪工作原理;组成： CCD摄像头 变焦镜、滤光片、近摄镜 暗箱 紫外透照仪 PCI图像捕捉卡 图像捕捉及分析软件 热敏打印机 电脑及显示器（OPTION） 功能：图像采集和分析;主要部件 光学系统（光源、滤光片、光电倍增管） 数据处理和传输系统 微量比色杯 波长：230、260、280、320、562、595nm 用于各种生物样品检测;核酸蛋白检测仪;主要部件 光学系统（光源、单色器、光电倍增管） 机械运动和定位系统（步进马达） 自动控制系统 数据处理和传输系统 波长：200-999nm，1nm步进 用于各种微孔板检测;全波长扫描酶标仪工作原理;荧光技术简介;一、荧光发生过程 荧光产生于某些分子（通常是含多聚芳香烃的碳水化合物或杂环化合物）称为荧光体或荧光染料。 荧光探针是一个荧光体设计用于定位生物样品的特异性区域或对特异性刺激因子发生反应。 荧光发生是一个3阶段的过程。;① 激发 外源的白炽灯或激光提供的能量（hvEX）的光子被荧光体吸收，产生被激发的电子单峰态（S1’ ）。这个过程是荧光和化学发光的区别，化学发光的激发态是由化学反应产生的。 ;② 激发态的寿命期 激发态存在一个有限的时间（通常是1-10x10-9秒）。在这时间，荧光体经历构象的改变和容易受到分子环境的相互作用的影响。这些过程有两个重要的结果。第一， S1’的能量部分被消耗，形成一个衰减的单峰激发态（ S1 ）即荧光发射的初始。第二，不是最初被激发的所有分子都通过荧光发射回到基态。其他的过程，象振动淬灭，荧光能量传递也在S1’衰减。荧光量子的产生量，取决于激发的荧光光子数量与吸收的光子数量的比率，是衡量荧光效率的参数。 ;③ 荧光发射 能量（hvEM）光子被激发，荧光体回到基态S0。由于能量在激发态寿命期的部分消耗，这些光子的能量较低，因此比激发光子hvEX有更长的波长。这种由于（hvEM - hvEX）呈现的能量或波长的差异称作Stokes漂移。Stokes 漂移奠定了荧光技术灵敏性的基础，因为它可以与激发光子在光谱上分离，而在一个较低的背景下检测发射光子。相比较而言，吸收光分光测定法在透射光检测时相对于较高水平的同一波长的光。 ;Emission;Emission;Excitation;二、荧光光谱 荧光发生的整个过程是循环的，除非荧光体在激发态不可逆转的破坏（一个重要的现象称作光漂白），同一荧光体可以反复地激发和检测。对于溶液中多原子分子，由hvEX和hvEM呈现的不连续的电子跃迁被一个较宽的能量光谱称作荧光激发光谱和荧光发射光谱取代。在两种或更多的荧光体同时检测时，这些光谱的带宽是非常重要的参数。除了很少的例外，一般在稀释溶液中单种荧光体的荧光激发光谱和它的吸收光谱是相同的。在同样条件下，由于在激发态寿命期激发能量的部分消耗，荧光发射光谱与激发波长是分离的。荧光发射强度是与在激发波长的荧光激发光谱振幅成比例的。;荧光光谱;三、荧光检测 荧光检测仪器 荧光检测系统的4个基本要素是：⑴激发光源，⑵荧光体，⑶将激发光子与发射光子分离的特定波长的滤光片，⑷检测器记录发射光子并输出，通常是电子信号或图像。 3种主要的荧光检测仪器提供不同的数据。 荧光分光光度计：测定液体样品（uL-mL） 荧光显微镜：解析荧光作为二维或三维空间位置定位功能 流式细胞仪：测定流体中每个细胞的荧光，在大量样品中进行分选并识别和定量 激光扫描仪;荧光信号 荧光强度的定量取决于这些参数：吸光度-由Beer-Lambert定律定义为摩尔消光系数的产物，光径和稀释浓