实验五_离子交换柱层析法分离氨基酸.ppt

实验六 离子交换柱层析法分离氨基酸 ;目的要求 （1）学习采用离子交换树脂分离氨基酸的基本原理。 （2）掌握离子交换柱层析法的基本操作技术。;一、原理;;; 带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。;离子交换过程示意： 起始 吸附 解吸 完成 x+ : 起始缓冲离子 y+ ：待分离离子 z+ ：待分离离子 ;二、离子交换剂的种类;（二）按载体种类不同 1.离子交换树脂：主要有聚苯乙烯树脂 苯乙烯+二乙烯苯 ? 聚苯乙烯 （单体）（交联剂） 二乙烯苯 交联度 = ———————— × 100% 苯乙烯 + 二乙烯苯;交联度大，网孔变小，大分子量的离子不能进入树脂颗粒内发生离子交换。 在不影响分离的情况下，以采用交联度较高的树脂为好，这样可以提高树脂对离子的选择性 。;目数：离子交换树脂的颗粒直径大小 Dowex 50 为20-50目 Dowex 20 840?m 50 297?m 100 149?m （代表二乙烯苯的百分含量）;树脂resin（据所含交换基团的性质分） 阳离子交换树脂 强酸型 含磺酸基团 (R-SO3H) 中等酸型 含磷酸基团 (-O-PO2H4) 弱酸型 含酚基、羧基 阴离子交换树脂 强碱 含季胺基团 [-N+(CH3)3] 弱碱 含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2 阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。 ;2.离子交换纤维素 阴离子交换纤维素 —如:DEAE-纤维素 pH8.6以下分离中性或酸性物质,具二乙胺乙基 阳离子交换纤维素—如:CM-纤维素 一般pH4条件下使用,具有羧甲基 ;3.离子交换凝胶— 分离大分子物质 如：葡聚糖（Sephadex）、 聚丙烯酰胺（PAG）、琼脂糖（Sepharose） ;三、操作注意点;考虑因素： 1.被分离物质带何种电荷 2.被分离物质分子的大小 大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素 3.被分离物质所处的环境 4.被分离物质的物理化学性质 5.被分离物质的大概数量 ;根据分离过程的实验条件 强酸强碱—应用广泛 弱酸型—只能在??性pH范围内使用 弱碱型—只能在酸性pH范围内使用;（二）缓冲液的选择 原则：不能发生化学反应，所带电荷应与样品一致。避免使样品变性 ;(三)洗脱剂 原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离子或基团 改变pH或离子强度 ?增强洗脱液与离子交换剂的结合力 ?降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱 ;四、应用;离子交换层析法分离氨基酸及测定 ;[原理] ;紫色物质，用于α－氨基酸的比色测定和纸层析显色;;[器材] ;[试剂] ;实验步骤 1．树脂的处理 将干的强酸型树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀。用4倍体积的2mol/L的盐酸浸泡1小时，倾去清液，洗至中性。再用2mol/L的氢氧化钠处理，做法同上。最后用欲使用的缓冲液浸泡。 2．装柱 取直径1cm,长度10－12cm的层析柱。将柱垂直至于铁架上。自顶部注入上述经处理的树脂悬浮液，关闭层析柱出口，待树脂沉降后，放出过量溶液，再加入一些树脂，至树脂沉降至8 ~ 10cm的高度即可。 装柱要求连续、均匀，无纹格、无气泡，表面平整。液面不低于树脂。; 3．平衡 将缓冲液瓶与恒流泵相连，恒流泵出口与层析柱入口相连，树脂表面保留3－4cm液层，开动衡流泵，以24ml/h流速平衡，直至流出液pH与洗脱液相同。 4. 加样 揭去层析柱上口盖子，待柱内液面至树脂表面1－2mm关闭出口，沿管壁四周小心加入0.5ml样品，慢慢打开出口，同时开始收集流出液。当样品液弯月面靠近树脂顶端时，即刻加入少量柠檬酸缓冲液冲洗加样品处数次，然后注入柠檬酸缓冲液至液面高3－4cm左右，接恒流泵。 5. 洗脱 以缓冲液洗脱，开始用试管收集洗脱液，每管收集1mL，共收集60—80管。;