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第四章 动物细胞工程制药;第四节　转基因动物;转基因动物;转基因硕鼠;生物反应器研发;Gordon于1987年获得了分泌组织纤溶酶原激活因子tPA的转基因小鼠。以后的数年内，转基因羊、猪、牛的乳腺生物反应器便相继问世，利用此生产出了多种生物药物：凝血因子Ⅸ、凝血因子XIII、抗胰蛋白酶、tPA、红细胞生成素（EPO）等。 动物克隆技术、干细胞技术等与转基因动物技术相结合，加快了动物生物反应器的研究与应用进程。;乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊 ;;二、转基因动物技术的原理和方法;外源目的基因的制备 外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择获得携有目的基因的细胞 选择合适的体外培养系统和宿主动物 转基因细胞胚胎发育及鉴定 筛选所得的转基因动物品系;（二）外源目的基因转入动物的早期胚胎方法;microinjection;基质附着序列;;优点： 转基因范围广 转移基因大，可达数百kb； 且转基因不含任何病毒基因组片段，绝对安全 。 非嵌合体 已成功制备转基因的鼠，兔，羊，猪 缺点：整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致转基因不表达 整合位点随机会造成转动物基因组的重排、突变、易位缺失等 需显微操作仪，技术性要求强。 成功率低;2.反转录病毒感染法;如果在第一次卵裂之前外源DNA整合到胚胎基因组中，可获得转基因动物 在第一次卵裂之后整合，会产生嵌合体，其第二代可能出现转基因动物。 ;（1）反转录病毒基因;（2）反转录病毒感染法的载体的构建;（3）包装细胞 ;（4）通过物理方法将重组DNA分子转入包装细胞;优点：同时感染大量胚胎 整合率高，转基因整合后能稳定地遗传 单拷贝整合型 不需复杂设备 缺点：外源基因难植入生殖系统，成功率低 载量较小，一般只有8 kb，不能插入大片段，缺少邻近的调控元件而影响转基因表达； ;3.胚胎干细胞方法;;ES细胞成为个体;2.通过核移植将ES导入去核的卵母细胞，在子宫种植发育成个体 ;胚胎干细胞转基因过程;1.ES细胞的建立与维持;2.ES细胞的基因组操作;与整合位点两端区域同源的两段DNA序列（HB1和HB2） 转入的目的基因（TG） 编码抗G418的新霉素磷酸转移酶基因（neor） 两个不的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2）;3.转基因ES细胞的筛选——正负选择法 ;4.转基因ES细胞的检测;;（6）获得纯合的转基因鼠;;4.精子载体导入法;意大利Lavitrano等1989年首次报道利用精子作为载体获得了转基因小鼠。 改进的方法是精子头部纤维注射 此法不仅可免去复杂而昂贵的设备，且可省去不少繁杂的操作和条件准备。 但该法有些结果不稳定，不能重复,外源DNA分子可能会受到受精液中内切酶的作用而影响整合后的功能 需在继续改进;5.基因打靶 (gene targeting);基因打靶的必备条件;基因敲除的技术路线如下： （1）构建重组基因载体﹔ （2）打靶载体导入ES细胞：重组置换 （3）基因敲除ES细胞注射入胚泡 （4）胚泡植入假孕小鼠的子宫中 （5）嵌合体的杂交育种 ;; O型载体，序列插入型载体，这类载体与靶基因组同源重组配对，经过一次交换，前者插入后者，它发生单交换而将载体序列插入靶基因内，致使染色体DNA部分重复，可能破坏内在正常基因而发生突变，也可代替原来缺陷基因，纠正遗传特征，使靶基因特异失活。 Ω型载体，也称序列取代载体，外来载体DNA和靶细胞染色体DNA同源配对，经过两次交换，前者取代后者，此类载体可与靶序列发生双交换，以外源序列取代靶序列，其基因组大小并无改变。;6. YAC (Yeast Artificial Chromosome)人工酵母染色体法;方法;三、转基因动物反应器;;（一）动物乳腺反应器;商业要求：?1g/L 乳腺是外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响到转基因动物本身的生理反应，从转基因动物的乳汁中获取的目的基因产物，不但产量高、易提纯，而且表达的蛋白经过了充分的修饰加工，具有稳定的生物活性，因此又被称为动物乳腺生物反应器 2006年8月，欧洲药品估计局（EMEA）批准了哺乳动物细胞乳腺生物反应器（改名为乳腺生物反应器） ;1、动物乳腺是一个封闭的系统：表达的蛋白绝大部分不会回到血液循环, 避免大量表达的外源蛋白对动物健康的危害。 2、乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器。奶牛一年生产乳蛋白250-300kg, 山羊生产乳蛋白25-30kg, 家兔生产乳蛋白也可达到3-5kg。 3、乳腺组织可以对人体蛋白质进行正确的修饰和后加工，生物学活性接近天然产品。 4、动物乳腺表达的外源基因可以遗传，获得生产有价值蛋白质的动物个体后,可以常规繁殖生产群体。;80年代，在鼠的乳腺组织高效表达了人AAT，开创了此研究的先河 全世界有20-30