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NR2B转基因小鼠学习记忆能力增强的分子机理研究 【摘要】：学习记忆是脑的一项高级神经功能。N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体，特别是其NR2B亚基在学习记忆过程中起重要作用，揭示其生理功能对阐明学习记忆的具体分子机理具有重要意义。前脑特异过表达NR2B亚基的转基因(Tg)小鼠表现为NMDA受体通道开放时间延长，活性增加，突触对10-100Hz刺激的反应增强，并在多种行为学测试中表现出更好的学习和记忆能力，但其确切的分子机理还未阐明。本研究首先利用定量PCR技术检测19月龄、24月龄Tg小鼠海马和皮层中NMDA受体NR1、NR2A和NR2B三个亚基的表达情况，然后运用基因芯片技术和定量PCR技术分别考察3月龄、19月龄和24月龄Tg小鼠海马和皮层中基因的表达变化情况，再利用cluster3.0软件进一步分析差异表达基因和相关的信号通路，初步探讨Tg小鼠学习记忆能力增强的分子机理。芯片结果表明，细胞内钙释放通道Ryranodine受体(RyR)及其相关基因Triadin2(Trdn)和富含组氨酸的钙结合蛋白(Hrc)，钙／钙调依赖的蛋白激酶Ⅳ(CaMIV)以及一些转录相关基因的表达都发生了改变。RyR基因已被证实在学习记忆中具有重要作用，但是其作用机理以及NR2B如何对之调节还不清楚。在突触后致密处，NR2B可通过PSD95-GFAP-Shank将Homer与NMDA受体复合物联系起来。而在骨骼肌中，Homer-1c可通过与RyR1和RyR2互作来调节其功能。所以我们推测骨骼肌中RyR-Homer-1c的互作也可能在脑中存在。另外，gyR不仅通过影响基因转录而影响学习记忆，而且还可被NO-cGMP-PKG通路激活，从细胞内钙库释放出大量的钙，增加CREB的磷酸化水平并产生晚期长时程增强(L-LTP)。而NO也是NMDA受体的下游通路之一，并参与调节CREB的磷酸化过程。为了考察RyR基因在学习记忆中的作用机制，本实验分别利用荧光定量PCR技术、免疫共沉淀技术以及Westernblot等分子生物学技术，考察RyR1-3及其相关基因的表达变化，RyR和Homer-1c的相互作用以及磷酸化的CREB蛋白水平的变化，进一步探讨Tg小鼠学习记忆能力增强的分子机理。1．老年NR2B转基因小鼠海马和皮层中NMDA受体三个亚基的表达情况【关键词】：NR2B学习记忆基因表达RyRHomer-1cPhospho-CREB 【学位授予单位】：华东师范大学 【学位级别】：博士 【学位授予年份】：2006 【分类号】：Q344 【目录】：第一章NR2B转基因小鼠基因表达谱分析14-101摘要14前言14-16第一节3月龄NR2B转基因小鼠基因表达谱分析16-411材料与方法16-202结果20-342.1组织总RNA质量检测20-212.23月龄Tg小鼠海马基因表达谱21-252.3定量PCR检测3月龄Tg小鼠海马基因表达变化25-282.43月龄Tg小鼠皮层基因表达谱28-312.5定量PCR检测3月龄Tg小鼠皮层基因表达变化31-343结论34-354讨论35-41第二节19月龄NR2B转基因小鼠基因表达谱分析41-621材料与方法42-432结果43-572.1组织总RNA质量检测432.219月龄Tg小鼠海马和皮层中NMDA受体各亚基的表达情况43-442.319月龄Tg小鼠海马基因表达谱44-472.4定量PCR检测19月龄Tg小鼠海马基因表达变化47-502.519月龄Tg小鼠皮层基因表达谱50-542.6定量PCR检测19月龄Tg小鼠皮层基因表达变化54-573结论57-584讨论58-62第三节24月龄NR2B转基因小鼠基因表达谱分析62-861材料与方法62-632结果63-792.1组织总RNA质量检测632.224月龄Tg小鼠海马和皮层中NMDA受体各亚基的表达情况63-642.324月龄Tg小鼠海马基因表达谱64-692.4定量PCR检测24月龄Tg小鼠海马基因表达变化69-722.524月龄Tg小鼠皮层基因表达谱72-772.6定量PCR检测24月龄Tg小鼠皮层基因表达变化77-793结论79-804讨论80-86第四节不同年龄NR2B转基因小鼠基因表达谱综合分析86-1011方法86-872结果87-953结论95-964讨论96-101第二章NR2B转基因小鼠学习记忆增强的可能分子机理101-116摘要101前言101-1031材料与方法103-1052结果105-1132.1三种不同年龄Tg小鼠中RyR及相关基因和转录相关基因mRNA水平的表达情况105-1122.2RyR与Homer-1c的互作112-1132.3CREB的磷酸化水平1133结论1134讨论113-116