第三章 细胞生物学方法概述.ppt

多莉 克隆猴 S=(dx/dt)/?2x =1?10-13sec. 差速离心 等电聚焦电泳 直接免疫荧光标记与间接免疫荧光标记技术 免疫印迹（western　blotting） SDS（或双向电泳）——转移到膜上——免疫显色 （二）特异蛋白抗原的定位与定性 原理：利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术。 类型： 免疫荧光技术 免疫印迹反应 免疫电镜技术 免疫铁蛋白技术 免疫酶标技术 免疫胶体金技术 （三）细胞内特异核酸的定位与定性 原位杂交技术 放射性同位素标记：利用放射性核素所放射出来的射线作用于感光材料的AgCl晶体，从而产生潜影，并通过显影过程把“像”显示出来，以研究用放射性核素标记的物质在生物体内的定位和定量的一种技术。 生物素标记 （四）定量细胞化学分析与细胞分选技术 细胞成分的细胞化学显示方法 福尔根反应：测定DNA含量 PAS反应：检测多糖 苏丹Ⅲ染色：检测脂滴 米伦反应：检测蛋白质 流式细胞术 可定量测定细胞中DNA、RNA或某一特异的标记蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量；它还可以将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，以及将DNA含量不同的中期染色体分离出来，甚至可用于细胞的分选。 三、细胞培养与细胞工程 细胞培养 细胞工程 （一）细胞培养技术 动物细胞培养 原代细胞培养 传代细胞培养 培养方法：贴壁培养、悬浮培养 植物细胞培养 愈伤组织诱导 4) 细胞悬浮培养 继代培养 5) 细胞团或愈伤组织再形成 单细胞分离 6) 植株的再生 （二）细胞工程 细胞融合（cell fusion）与细胞杂交（cell hybridization）技术 重组DNA技术 单克隆抗体（monoclone antibody）技术 细胞拆合与显微操作技术 1、细胞融合技术 两种或两种以上细胞融合在一起的技术 病毒诱导，PEG，电击融合 植物和微生物用原生质体 应用：很广，如杂交瘤 2、重组DNA技术 传统的DNA扩增：分子克隆法 聚合酶链反应PCR (polymerase chain reaction) DNA顺序分析 PCR 1983年由美国PE-Cetus公司的Mullis等发明，1985年公开报道的一种体外核酸扩增系统。 原理：由引物（模板片段两端的已知序列）介导，聚合酶（如Taq DNA聚合酶，依赖于模板）催化底物（4种脱氧核苷酸），在体外进行特异DNA（目的基因等）扩增（或合成）的一种方法。 步骤： 变性：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链； 退火：突然降温后模板与引物按碱基配对原则互补结合； 延伸：在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下，以单核苷酸为底物，从引物的3’端开始合成，形成了与模板链互补的新DNA链。 循环一次，DNA量增加一倍；经过25-30个循环，DNA可扩增106-109倍。 优点：快速（数小时）、灵敏（ng）、操作简便（自动化）等。 3、单克隆抗体技术 1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗体技术，获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。 每个B淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限增殖，因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内条件下分泌大量单克隆抗体。 单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体。 4、显微操作技术 仪器：显微操作仪 显微操作的应用 显微注射：标记蛋白、外源DNA的导入 核移植 转基因动植物 动物克隆 动物克隆 生物繁殖后代通常是以精、卵细胞结合的有性生殖方式进行。 通过营养体细胞繁殖个体的方法称为无性繁殖。 克隆是指离体条件下的无性繁殖。 1981年Illmenses 率先报告用小鼠幼胚细胞核克隆出正常小鼠。随后，1984年Willadsen用未成熟羊胚细胞核克隆出一头羊。 英国PPI生物技术的罗斯林（Roslin）研究所的维尔穆特(Wilmut)博士1997年2月27日在世界著名权威杂志《Nature》宣布的用乳腺细胞的细胞核克隆出一只绵羊“多莉 (Dolly) ”的消息。“多莉”的诞生，既说明了体细胞核的遗传全能性，也翻开了人类以体细胞核竞相克隆哺乳动物的新篇章。此项技术因而荣登美国《Science》周刊评出的1997 年十大科学发现的榜首。 绵羊B 乳腺细胞核 易核卵 融合卵 绵羊C子宫 多莉 植入 植入 生产 克隆多莉羊示意图 取出 未受精卵 去核 电激 体外胚胎发育 绵羊A “多莉”的产生与三只母羊有关；一只是芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊