细胞的转染技术分析报告.pptx

细胞转染技术原理：细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为一种电容，其静膜电位（Vm）约为l00mV，导电性很差。当把细胞置于外加电场中时，会使膜电位升高，双分子层两端电压形成差势，随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩变薄，当膜电压升到一定数值时，膜被击穿。可逆击穿：击穿小孔可在一定时间内复原。不可逆击穿：击穿小孔不可修复，处理细胞成活率低。操作程序：将盛有细胞和DNA混合物的特制小容器置于电脉冲仪的正负极之间，在0度下加高压（2～4KV），电脉冲10分钟后，将待处理的细胞转移到新鲜培养基中生长2天，再进行筛选。存活细胞的回收率约为60%～80%。首先利用微小的金、钨等金属颗粒相DNA吸附，然后在高压作用下将DNA伴随金颗粒高速进入细胞，由于微粒的直径一般在0.5-0.9Fm之间，远小于细胞。因此可直接将DNA导入细胞质中，这种方法能有效地使DNA在活体组织、贴壁细胞和悬浮细胞中表达。由于该方法的高转染效率，通常只得少量DNA即可获得外源基因的表达并激发有效免疫应答。首先将钨、金微粒(直径约0.4μm，重量约0.05mg)与供体DNA溶液(1～2μl)混合并保温，使DNA吸附在金属微粒的表面，然后将该溶液置于所谓的“基因枪”仪器中，仪器高压放电将金属微粒加速，直接喷射受体原生质或细胞，细胞击穿成孔后，在钨粒上的DNA以及溶液中的DNA都可以进入受体细胞。操作技术程序为：裸DNA直接注射1990年Wolff等首次注意到给小鼠直接肌肉注射纯化的DNA或RNA重组表达载体，可使载体上的基因在局部肌细胞内表达，这种表达可持续数日或更长时间，且没有检出注射的外源核酸与宿主染色体整合。随后的大量动物实验都说明在合适的条件下，DNA接种后可诱导机体产生细胞及体液免疫。于是，作为一种新的基因治疗手段——核酸免疫技术应运而生。基因表达1.Prokaryoticexpressionvector原核表达载体2.Baculovirusexpressionvector昆虫杆状病毒表达载体3.Mammalianexpressionvector哺乳动物表达载体4.Adenoviralandretroviralvector腺病毒及逆转录病毒表达载体Prokaryoticexpressionvector原核表达载体GST-fusion6xHis-fusionGSTHIS基因功能研究Overexpressionincells超表达，观察表型RNAi干扰技术Yeasttwohybridsystem酵母双杂交等技术寻找与目的基因相关的蛋白Proteinexpressionandantibodypreparation表达蛋白与抗体制备Localizationofprotein蛋白在细胞中的定位TheConstructionofAdenovirusVectorsBackgroundRecombinantadenovirusescurrentlyareusedforavarietyofpurposes,includinggenetransferinvitro,vaccinationinvivo,andgenetherapy.Thegenomeofthemostcommonlyusedhumanadenovirus(serotype5)consistsofalinear,36-kb,double-strandedDNAmolecule.Bothstrandsaretranscribedandnearlyalltranscriptsareheavilyspliced.Viraltranscriptionunitsareconventionallyreferredtoasearly(E1,E2,E3,andE4)andlate,dependingontheirtemporalexpressionrelativetotheonsetofviralDNAreplication.Inmostrecombinantvectors,transgenesareintroducedinplaceofE1orE3,theformersuppliedexogenously.TheE1deletionrendersthevirusesdefectiveforreplicationandincapableofproducinginfectiousviralparticlesintargetcells;theE3regionencodesproteinsinvolvedinevadinghostimmunityandisdispensableforviralproduction.AdvancementsofAdenoviruseBroadhostrangeandlowpathogenicityin