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第十三章 转基因技术与作物育种 第一节 作物的转基因技术 一、植物转基因育种的程序 目的基因的获得 含目的基因重组质粒的构建 受体材料的选择 转化方法的确定和外源基因的转化 转化植株的鉴定与筛选 安全性评价与育种利用 二、植物转基因方法概述 1.农杆菌介导的遗传转化 2.基因枪转基因 3.花粉管通道法 1.农杆菌介导的遗传转化 Ti质粒包括5个区域 1.LB与RB之间的T－DNA，这断序列整合到基因组中；2.质粒转移区（PT）；3.冠瘿碱代谢区；4.复制原点；5.毒性区 根瘤细胞的形成是因为土壤农杆菌中存在着一种诱导瘤细胞（Tumor-inducing)的质粒,这种质粒称为Ti质粒； 农杆菌介导的遗传转化方法研究及宿主范围的拓展 农杆菌较易侵染双子叶植物，对单子叶植物不敏感；通过改变以下条件，现已经获得水稻、小麦、玉米、甘蔗等转基因植株 1.使用酚类物质诱导vir基因表达 2.广寄主范围农杆菌菌株的筛选 3.使用单子叶植物特异启动子和利用分生组织与农杆菌共培养 植株原位转化(in planta transformation) 植株抽真空20分钟，使细菌进入植物细胞间隙，或者将花朵抽真空让细菌进入，甚至直接用菌液浸泡植株 避免了细胞培养过程，单转化效率不高 影响农杆菌转化的因素 农杆菌菌株 农杆菌菌株高浸染活力的生长时期 基因活化的诱导物 外植体的类型和生理状态 外植体的预培养 外植体的接种和共培养 2.基因枪转基因 通过高压气体等动力，高速发射包裹有重组DNA的金属颗粒，将目的基因直接导入受体细胞，并整合到受体上的方法 带有目的基因的克隆载体 氯化钙沉淀法制备微弹 安上了微弹的基因枪 基因枪轰击植物样品 转化细胞的组织培养 再生的转基因植株 3.花粉管通道法 是一种直接转化植物种质细胞的技术。它将基因工程技术和传统育种技术相结合，通过创造变异、选择变异、优化农艺性状，实现农作物的分子育种。 （1）作物的开花习性及受精生物学（棉花） 棉花生殖器官的解剖结构 花器结构：花器、雌蕊、子房、胚珠 花粉管通道 棉花的开花习性和受精过程（略） （2）作物种质转化系统或生殖系统转化的机理（棉花） 双受精过程完成后，受精卵细胞的初次分裂需要充分的物质和能量积累。此时期的细胞尚不具备完整的细胞壁和核膜系统，细胞内外的物质交流频繁。通过花粉管通道渗透进入胚囊的外源DNA片断有可能进入受精卵细胞，并进一步地通过尚不明确的机理被整合进受体棉花的基因组中。 （3）花粉管通道法对作物的转化 导入总DNA 导入基因 （4）花粉管通道法的优缺点 优点 不依赖于植物组织培养和诱导再生植株等一整套人工培养过程 花粉管通道是天然存在的，理论上讲，该方法可用于任何开花植物，从而极大地扩展了受体植物种和品种的范围。 转基因植株的鉴定方面，可以直接鉴定转基因植株，避免使用选择标记基因或报告基因 转化速度快，转化效率可达1％左右 方法简便，适合大规模的遗传转化 缺点 进行外源基因转化的工作时间受受体作物自然花期的限制，同时必须充分了解每一种植物的开花受精生物学特性及其时间进程。 在田间进行操作，受环境条件的影响较大。 操作的经验性很强，需要一定的技术摸索和技巧 对单籽粒的小花农作物，操作难度大。 （5）作物花粉管通道法的操作程序及影响因素（棉花） 影响转化率的因素 掌握受体植物的受精过程及时间规律，是花粉管通道法转化的关键因素之一。棉花的株心孔道开放时间大约在授粉后12－28h左右。因此一定要掌握导入DNA的时间。 供体DNA片断的纯度对转基因植株的获得及后代的表型变异有一定的影响 微注射时，既要保证子房能够获得足量的DNA溶液，又要尽量减轻对子房的机械损伤及由膨压引起的伤害。 第二节 转基因作物的遗传特点 外源基因整合的机制 整合后的外源基因在植株体内的表现 外源基因在后代中的遗传规律 一、外源基因整合的机制 同源重组整合 位点特异性重组 转座作用 异常重组 二、整合后的外源基因在植株体内的表现 转化频率 能否表达 表达水平 基因沉默：顺式失活、反式失活、共抑制 三、外源基因在后代中的遗传规律 一个位点的整合：3：1 二个位点的整合：15：1 63：1 第三节 转基因植物的应用 第四节 转基因作物品种的选育 转基因作物育种目标的制订 转基因方法的确定及转基因植株的获得 转基因作物品种的选育 一、转基因作物目标的制订 依据市场经济的需要和生产发展前景 依据不同的自然环境、栽培条件，抓主要矛盾 落实具体性状目标 要考虑品种搭配 要充分考虑到转基因作物，尤其是外源目的基因对人类健康和环境安全的影响 二、转基因方法的确定及转基因植株的获得 方法：农杆菌介导，基因枪，花粉管通道 受体品种选择 三、转基