第四章人工染色体载体讲课.ppt

1．提取的基因组DNA长度小于200 kb 2．提取的总DNA纯度不高，酶解受到抑制，须梯度离心(gradient centrifugation) 3．无外源DNA，单个cos位点载体 → 5%空，双cos低得多，charomid 高→ 20% 4．重组质粒(recombinant plasmid)拷贝数差异大，导致收获量相差悬殊 5．尽管文库似乎全面，但也许不能获得目的克隆，限制酶位点(restriction sites)的非随机分布，污染限制酶，重组缺失，扩增时目的克隆可能被淘汰。 酵母的生物学特征 Saccharomyces cerevisiae 酿洒酵母 扁圆形和卵形 ?3?m 代时90min 16条染色体 300-2000kb 14×106bp 14Mb 具真核mRNA的加工活性 第二节 酵母人工染色体载体 yeast artificial chromosome yeast 一、YAC载体的复制元件和标记基因 1.复制必须成分 复制起点ori，自主复制序列ARS (autonomously replicating sequence) 着丝粒（CEN） 使染色体(chromosome)在分裂过程中能正确分配到子细胞中有丝分裂(mitosis)中与纺锤丝(spindle fiber)联系的那段DNA 两个端粒(telomere) 即末端基因，末端复制所必需，且可防止染色体被核酸酶降解 2.选择标记(selective labeling) Trp URA3 Leu2 His (营养缺陷型,auxotroph) 3.筛选模型 SUP4抑制基因： 宿主菌为ade2-1 赭石突变(ochre mutant) Ade2-1’sup4 白色菌落 Ade2-1 红色菌落 TEL ori/ampr Trp1 ARS1 CEN4 BamHI BamHI SmaI His3 TEL ori/ampr Trp1 ARS1 CEN4 Sup4 URA3 TEL BamHI SmaI URA3 TEL SmaI 原生质体和电转化 URA3/trp ade2-1赭石突变株 红色菌落即为阳性克隆子 BamHI 二、YAC载体的工作原理 缺点： 基因组DNA与YAC臂体外连接过程中 产生嵌合体 通过共转化(cotransformation)导入同一个酵母原生质体(yeast protoplast)的不同YAC克隆的有丝分裂重组也会产生嵌合体 染色体DNA操作困难 Tra region 21 genes ori ori parA, parB F质粒 Cavalli-Sforza(1950)和Hayes（1952） 大肠杆菌(E.coli)接合交配期染色体标记的单向转移 大小约100kb，编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质 可以整合到宿主染色体中，在大肠杆菌 染色体中有30多个位点进行随机整合(random intergration) 第三节 细菌人工染色体载体 bacterial artificial chromosome 自然发生的F因子能携带1/4的大肠杆菌染色体而不显张力或不稳定 拷贝数低: 1 有助于减少DNA 分子间重组 保证文库转化子生长平衡 减小对受体菌的毒副作用 F质粒改造成载体的设想 7507bp U5113 一、BAC载体及其结构组成 大小约7.5kb，属于质粒克隆载体 与常规克隆载体核心区别：复制单元来自F质粒，包括严谨型复制区oriS、解旋酶RepE、基因座（parA、parB、parC） 标记基因为氯霉素抗性 可利用α-互补筛选重组子 电转化(electroporation)：106/ug DNA，10-100倍高于原生质体转化(protoplast transformation) 可用于传统的菌落杂交(colony hybridization) 重组DNA为 ccc质粒，而不是线性 可用PFGE检测DNA大小 低频co-cloning BAC载体克隆的片段大小 10-215kb，平均100kb，少量大于 300kb 二、BAC载体工作原理 BAC载体的工作原理与常规质粒克隆载体相似 BAC文库构建: 1. 大片段DNA制备 琼脂糖凝胶包埋