第十六章沉淀分离法讲课.pptVIP

（一）基本原理 加入有机溶剂后，会使系统（水和有机溶剂的混合液）的介电常数减小，而使溶质分子（如蛋白质分子）之间的静电引力增加，从而促使它们互相聚集，并沉淀出来。 水溶性有机溶剂的亲水性强，它会抢夺本来与溶质结合的自由水，使其表面的水化层破坏，导致溶质分子之间的相互作用增大而发生凝聚，沉淀析出。 常用于生物大分子沉淀的有机溶剂： 甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等， 其中乙醇是工业上最常用的 （二）影响沉淀效果的因素 温度 pH 中性盐浓度 金属离子 1.温度的影响 有机溶剂存在下，多数蛋白质的溶解度随温度降低而显著的减小，因此低温下（最好低于0oC）沉淀得完全，有机溶剂用量可减少。 实际操作中： 有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，从而增加对蛋白质的变性作用。 整个操作过程应在低温下进行。 具体操作时： ① 将待分离溶液和有机溶剂分别进行预冷： 蛋白质溶液冷却到0oC左右， 有机溶剂预冷到-10oC以下 ② 为避免温度骤然升高损失蛋白质活力，操作时应不断搅拌、少量多次加入。 ③ 使沉淀在低温下短时间处理后即进行过滤或离心分离，接着真空抽去剩余溶液或将沉淀溶入大量缓冲溶液中以稀释有机溶剂，旨在减少有机溶剂与目的物的接触。 温度的控制应根据蛋白质的稳定性而不同，稳定性较差的物质，冷却至低温是必要的；但对于稳定性较好的物质，如淀粉酶，温度不需过低，10-15oC。 2.pH的影响 在等电点时蛋白质溶解度最低，因此有机溶剂沉淀时溶液pH多控制在蛋白质等电点附近。 pH的控制必须考虑蛋白质的稳定性： 某些酶的等电点在pH4-5之间，比其稳定的pH范围低，因此pH应首先满足蛋白质稳定性的条件。 控制pH时应使大多数蛋白质分子带相同电荷，不要让目的物与主要杂质分子带相反电荷，以免共沉。 3.无机盐的离子强度 少量的中性盐能够减少蛋白质变性。在有机溶剂沉淀时中性盐浓度以0.01-0.05 mol/L为宜。 常用中性盐: 乙酸钠、乙酸铵、氯化钠 中性盐浓度较高时（0.2 mol/L以上），由于盐溶作用会增大蛋白质的溶解度，此时需增加有机溶剂的用量才能使沉淀析出。 对盐析后的上清液或沉淀物，如进一步用有机溶剂沉淀法纯化，必须先脱盐。 4.金属离子 一些金属离子，如Ca2+、Zn2+能与蛋白质结合形成复合物，使蛋白质溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成，并减少有机溶剂用量。 使用时避免能与这些金属离子形成难溶盐的阴离子存在（如磷酸根）。 常用的锌盐：醋酸锌或硫酸锌 5.有机溶剂沉淀法的优缺点 （1）优点： ① 乙醇等有机溶剂易挥发除去，不会残留于成品中，产品更纯净（不需要脱盐处理）； ② 有机溶剂密度低，沉淀物与母液间的密度差较大，分离容易，适于用离心分离收集沉淀物。 （2）缺点： ① 容易使蛋白质变性，操作需要在低温下进行，使用上有一定的局限； ② 采用大量有机溶剂，成本较高。 为节省用量，通常将蛋白质溶液适当浓缩，并回收溶剂。 ③ 有机溶剂易燃易爆，工业生产上车间和设备都应有防护措施。 等电点沉淀法 成盐沉淀法 高分子聚合物沉淀 选择性变性沉淀法 三、其他沉淀方法 1.等电点沉淀法 两性物质在pH=pI时，分子表面净电荷为零，分子间静电排斥作用减弱，因此吸引力增大，能相互聚集，发生沉淀。 不同的两性物质，pI不同，如不同蛋白质。根据这一特性，用依次改变溶液pH的方法可将不同的蛋白质分别沉淀析出，达到分离纯化的目的。 只适用于水化程度不大、在pI时溶解度很低的两性物质，如酪蛋白。 对于亲水性很强的两性物质，在pI及pI附近仍有相当的溶解度，用该法沉淀不完全，而且许多生物分子的pI很接近，因此很少单独使用。 往往与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法结合起来。 采用该法时必须注意： 溶液pH不会影响到目的物质的稳定性。 等电点沉淀法可用于所需物质的提取，也可用于沉淀除去杂蛋白及其他杂质，实际工作中普遍采用该方法作为去杂手段。 如在工业上生产胰岛素时： 先调pH至8.0去除碱性杂蛋白，再调pH至3.0去除酸性杂蛋白。粗酶液经过这样的处理后纯度大大提高，有利于后面的操作。 2.成盐沉淀法 某些生化物质（如核酸、蛋白质、多肽、氨基酸、抗生素等）能和重金属、某些有机酸及无机酸形成难溶性的盐类复合物而沉淀。 金属离子沉淀法 有机酸沉淀法 无机酸沉淀法 注意：形成复合盐后，常使蛋白质发生不可逆的沉淀，应用时必须谨慎。 （1）金属离子沉淀法 许多有机物（包括蛋白质）在碱性溶液中带负电荷，因此能与金属离子形成金属复合盐沉淀。