基因工程原理-第二章 DNA重组.ppt

基因工程原理 Principle of Gene Engineering 第二章 DNA重组 第一部分 DNA的组成和结构 1.1 DNA的组成 1.2 DNA的空间结构 1.3 DNA复制 复制子 复制子的数量 1.4 DNA转录启动子和转录区的结构 1.5 DNA转录终止子（transcription terminator） 1.6天然DNA的来源和用途 染色体DNA：分离目的基因的主要材料，1000～106kb 病毒DNA：用于构建基因克隆载体,T4、λ… 质粒DNA：用于构建基因克隆载体 线粒体DNA：呼吸作用的基因 叶绿体DNA：光合作用的基因 （1）大肠杆菌源质粒DNA的提取 （2）λ噬菌体DNA的提取 （3）氯化铯法制备植物基因组DNA 1.8 DNA的纯化 第二部分 基因工程工具酶 基因工程工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶和激酶 DNA聚合酶和RNA聚合酶 DNA和RNA修饰酶。 一、序列特异的DNA限制性内切核酸酶 (Restriction endonuclease, RE） ——指能够识别双链DNA分子中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的核酸内切酶。 来源：原核生物 种类：500多种 作用：把外源DNA切割成片段。 RE的功能: 防御外源DNA感染,利于遗传的稳定性 RE抑制了细菌种属间的交叉繁殖,但甲基化酶的某些误差,又使得不同菌株间DNA的重组成为可能,利于生物的进化. 3.1.1限制性核酸内切酶作用机制 （1）在DNA分子双链的特异性识别序列部位,切割DNA分子,形成链的断裂. 识别序列:又叫靶子序列,是由4-8个核苷酸组成的特定核苷酸序列. （2）识别序列在DNA分子上出现的频率 同裂酶(isoschizomer)---来源不同,但识别同样的核苷酸靶子序列. 例如:Hpa II和Msp I的识别序列都为 3.1.3 限制性核酸内切酶切割DNA的位点 DNA片段末端种类： 反应总体积：20微升 酶的用量 缓冲液的组成与酶的种类有关 反应时间1-3小时。 底物DNA： 标准缓冲液的组成： Star活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA。 二、DNA连接酶 3.2.1 DNA连接酶的作用机理 3.2.2 目前常用的DNA连接酶 1条DNA链具有3’-OH,另1条DNA链具有5’-P,而且3’-OH 与5’-P是相邻的. 3’-OH 与5’-P位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸的末端. 吸能反应: E.coli DNA 连接酶需要NAD+，T4 DNA 连接酶需要ATP. ——反应温度：37℃ ——酶用量：平末端1-2unit 粘性末端0.1unit ——ATP：10μmol/L—1mmol/L ——buffer：Tris-HCl，KCl，DTT，BSA 具互补粘性末端片段之间的连接 具平末端DNA片段之间的连接 DNA片段末端修饰后进行连接 具平末端DNA片段之间的连接 DNA片段末端修饰后进行连接 DNA聚合酶包括： 1956年，美国Kornberg从大肠杆菌中分离出来。 由大肠杆菌基因polA编码， 单链多肽蛋白质。 分子量：109 kD 球形，Φ65埃 1. DNA聚合酶I反应需要的条件: 全部4种脱氧核苷三磷酸,和Mg++. dATP dCTP dTTP dGTP 带有3’-OH游离基团的引物链. 2. DNA聚合酶I催化的反应 (1)聚合反应:5’→3’方向 DNA聚合酶I催化的聚合反应是在引物链3’-OH与dNTP分子的-P-基团间. dNTP接上后,又提供了1个3’-OH末端,继续连接dNTP分子. 合成方向是5’ →3’ (2) 5’ →3’核酸外切酶活性: (3) 3’ →5’核酸外切酶活性: 3、DNA聚合酶I在基因工程中的应用 DNA缺口转移（nick translation）反应——用于分子克隆。 制备高比活的DNA探针。 （二）大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段与DNA末端标记 Klenow聚合酶的特点： 分子量：76×103dal 具有聚合酶的活性 具有3’-5’的核酸外切酶的活性。 Klenow聚合酶的应用： cDNA克隆中第二链合成的催化 补平双链DNA的3’凹端。 标记DNA片段的末端：带标记的dNTP DNA序列测定：Sanger末端终止法 （三）T4 DNA聚合酶 从T4噬菌体中分离的 噬菌体基因43编码 具有5’→3’聚合酶活性 具有