基因工程实验-20100919.ppt

基因工程实验 周景文 江南大学 生物系统与生物加工研究室 * 概述 PCR DNA/RNA的凝胶电泳 质粒提取 基因组提取 常用工具酶 怎样把一个基因连接到质粒上？ 怎样把几个片段连接到一起？ 基因敲除 过量表达 质粒的结构 常用软件 常用网址 常用供应商 1. PCR 酶的选择： 普通的DNA聚合酶：Taq末端有A尾，可以直接用于TA克隆，连接到T载体上； 高保真的DNA聚合酶：Pfu (Pyrobest)末端无A尾，无法直接连接至T载体上。 反应条件的选择： Mg2+: 过低反应无法进行，过高易产生错配； Mn2+: 使错配率增加，用于易错PCR，进行定向进化。 特殊的PCR： 融合PCR(与SOE-PCR原理一致)： 见文献： Shevchuk, N. A., A. V. Bryksin, et al. (2004). Construction of long DNA molecules using long PCR-based fusion of several fragments simultaneously. Nucleic Acids Res 32(2): 12. Szewczyk, E., T. Nayak, et al. (2006). Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans. Nat. Protoc. 1(6): 3111-3120. 2. 巢式PCR 目前已经较少用到。 3. 易错PCR (Error-Prone PCR) 用于随机突变。通过控制Mg2+和Mn2+的浓度实现。 2. DNA/RNA凝胶电泳 电泳基质主要分为琼脂糖和聚丙烯酰胺两类 平常我们主要用琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖浓度的选择一般按下表，1%的琼脂糖最为常用，可以分离分子生物学操作中常见的片段大小。 3. 质粒提取 细菌： 碱裂解法； 试剂盒； 破壁一般采用溶菌酶(Lysozyme)。 酵母 酶破壁+碱裂解法； 试剂盒； 破壁一般采用Lyticase (有的公司称为Zymolyase)或玻璃珠法； 后续步骤基本相同。 4. 基因组提取 细菌： 试剂盒； 破壁一般采用溶菌酶(Lysozyme)。 酵母 试剂盒； 破壁一般采用Lyticase (有的公司称为Zymolyase)或玻璃珠法； 后续步骤基本相同。 5. 常用工具酶 基因工程中常用到的工具酶包括： Lysozyme/溶菌酶：用于酵母和植物破壁用的裂解酶； Lyticase：用于酵母和植物破壁用的裂解酶； RNA酶：用于降解提取DNA中的RNA； DNA酶（DNA外切酶）：用于去除RNA或蛋白质样品中的DNA； DNA聚合酶：用于PCR，常用Taq和Pfu； 反转录酶：用于从mRNA反转录得到cDNA； 各种限制性内切酶； 连接酶； 碱性磷酸酶：用于连接前处理，常用CIAP（小牛肠碱性磷酸酶）； 共性：除RNA酶和Taq/Pfu之外，基本上都对热不稳定，需要在-20?C保存，使用时也需要尽量放置冰上！ 5.1 限制性内切酶 定义： 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）:识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。 [单位定义] ：在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。 详见：/view/48578.htm 最常用的内切酶： BamHI、EcoRI和HindIII 价格最便宜，最容易切开，最容易连上！ 如果有可能，尽可能优先考虑这3种内切酶。 5.2 连接酶 定义： 又称合成酶，能催化两个分子连接成一个分子或把一个分子的首尾相连接的酶。此反应与ATP的分解反应相偶联。在把两分子相连接的同时发生三磷酸腺苷（ATP)的高能磷酸键的断裂如DNA连接酶等。 在基因操作中，特指能将两个片段通过粘性末端或平末端连接起来的一类酶。 通常用于将DNA片段连接到质粒上。 目前主要用的是一种来源于T4噬菌体的连接酶，通常称为“T4 DNA连接酶”。 6. 怎样把一个基因连接到质粒上？ Taq，ExTaq，LA-Taq的PCR产物，直接连接至T载体上； 各家公司对T载体的命名方式不一样，需要仔细查看相关的说明文件。 设计了酶切位点的PCR产物： 单酶切后插入经过相应酶切后的载体上；此处需要用碱性磷酸酶处理酶切后的载体，一般用CIAP； 双酶切后插入经过相应酶切后的载体上；原则上需要用碱性磷酸酶处理酶切后的载体，但双酶切中基本上忽略，但对于一些酶切效率较低的酶，最好处理载体； 通过同源重组连接入载体： 在PCR引物两端设计与酶切后载体同源的序列(15 - 20 bp)，通过同源重组酶连接至载体上(Invitrogen称为Topo克隆