噬菌体裂解液的制备和菌种的保藏、噬菌体效价的测定、细菌转导测定、凝聚反应、沉淀反应.docxVIP

微生物学实验 实验名称 噬菌体裂解液的制备和菌种保藏 噬菌体效价的测定、细菌转导的测定 凝聚反应、沉淀反应 姓名 学号 系别 班级 实验日期 同组姓名 [实验原理及摘要] 1、噬菌体效价的测定 溶原性细菌经紫外线照射诱导后，使原噬菌体从细菌染色体上脱离而进入裂解周期，在宿主菌细胞内进行复制和组装，形成大量完整的噬菌体粒子。细菌被裂解，释放出游离的噬菌体粒子，通过离心，获得噬菌体裂解液。噬菌体的效价是指1mL噬菌体裂解液中所含噬菌体的数量在含有敏感宿主菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑，根据噬菌斑形成单位（plague-for ming units, pfu）进行噬菌体效价的测定，一般用双层琼脂平板法测定。 2、细菌转导的测定 转导可以分为两种类型，即普遍性转导和局限性转导。本实验为局限性转导，以双重溶原性细菌E. coli K12 F(λ)gal-为供体，经紫外线（UV）诱导，在噬菌体裂解液中将含有两种类型的噬菌体（λ和λdg）。λdg是缺陷噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因(gal)，当缺陷型噬菌体λdg再次侵染敏感菌大肠杆菌K12 S时，会将发酵半乳糖的基因转移到S菌，使S菌获得基因gal，从而使S菌获得发酵半乳糖的能力。利用转导子在EMB培养基上发酵半乳糖的特征进行转导频率的计算和分析。 3、凝聚反应 凝集反应是指颗粒型抗原与相应抗体混合时，在电解质的影响下，形成肉眼可见的凝集块。电解质的作用主要是消除抗原-抗体复合物表面的电荷，使其失去同种电荷相斥的作用，抗原-抗体复合物失稳而相互凝聚。温度升高加速分子运动使凝集反应速度加快，一般反应在37℃或56℃水浴中进行。发生明显凝集反应（反应强度为++）的最高稀释度的倒数值为该免疫血清的效价。凝集反应试验可分为玻片凝集试验和试管凝集试验。前者的优点是简便快速，是鉴定传染病标本细菌的重要手段。后者是一种定量方法，可利用已知抗原鉴定相应抗体的效价。 4、沉淀反应 沉淀反应与凝集反应的基本原理相同。不同的是沉淀反应所采用的抗原是可溶性的，如血清、细菌渗出物等。由于抗原是可溶的，抗原与抗体反应的结果时形成很细微的沉淀。沉淀反应可以在液体中进行，也可以在凝胶中进行。以液体形式在试管中进行时，抗原与抗体在交界面处形成环状的乳白色沉淀物，故称环状沉淀反应。双向琼脂扩散法是将抗原和抗体分别加入琼脂凝胶版小孔中，两者互向对方扩散，相遇后若特异性结合且比例适当，形成乳白色沉淀线。 [实验目的] 1、了解温和噬菌体与宿主菌之间的溶原关系。 2、学习利用溶原性细菌制备噬菌体裂解液的方法。 3、了解菌种保藏的基本原理和方法。 4、学习微生物大小的测量。 5、学习噬菌体效价测定的方法 6、了解转导原理、学习转导实验方法 7、学习凝集反应和沉淀反应的实验方法 8、了解血清学反应在实际中的应用 9、了解凝集反应的基本原理 [实验材料] 菌种：大肠杆菌E.coli K12 F gal+（双重溶源菌，含有λ噬菌体和缺陷型噬菌体λdg的基因组，发酵半乳糖）；大肠杆菌E. coli K12 S gal-（非溶源菌，对噬菌体敏感，不发酵半乳糖） 培养基：牛肉膏蛋白胨固体及液体培养基、加倍肉汤培养基、半固体素琼脂、磷酸盐缓冲液（0.1mol/L,pH7.0）、无菌水、氯仿、EMB培养基 仪器及用具：试管、三角瓶、离心机、离心管、振荡器、培养皿、紫外灯（UV灯，30W）、磁力搅拌器、涂布器、酒精灯、恒温水浴箱、培养箱等 其他材料： E. coli及其抗血清 人IgG及兔抗人Ig G 载玻片、1%琼脂糖、打孔器等 [实验内容及步骤] 一、噬菌体裂解液的制备和菌种保藏 1、菌种活化 弃上清，用等体积PB（2mL）悬浮细胞，制成菌悬液 2、UV诱导及增殖培养 加0.2mL 氯仿，震荡30S，静置5分钟； 离心（3000rpm, 10min）， 收集上清（噬菌体裂解液）。 3、菌种保藏 原则：干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养、添加保护剂等。 二、噬菌体效价的测定、细菌转导的测定 1、噬菌体效价的测定 1）受体菌（E. coli k12 S gal-）活化 2）噬菌体裂解液的制备 取0.5mL前述制备的噬菌体裂解液，用每管4.5mL牛液将噬菌体裂解液稀释到10-4 3）倒平板 牛肉膏蛋白胨培养基：5个平版 EMB培养基：5个平板 4）将素琼脂溶化，保温于50℃，向每支素琼脂中接入0.5mL K12 S gal-，混匀，再分别取噬菌体裂解液0.5mL（10-3、10-4），加入到素琼脂中，摇匀后立刻倒在牛肉膏蛋白胨平板上。 5）培养 待平板凝固后于37 ℃，培养12~16h； 根据噬菌斑数量计算噬菌体效价。 噬菌体效价菌体数·mL-1