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PCR基础 质监部 钟少芬 体内DNA合成过程 半保留复制 半不连续合成 :一条链是连续合成的(前导链leading strand), 而另一条链（随从链，lagging strand）是不连续合成的：冈琦片段。 体内DNA合成过程 合成过程： 1、螺旋的松弛与解链 2、引发 ：引物酶（primase）以DNA为模板，自5‘→3’合成RNA小片段约十几到几十个核苷酸。 3、 DNA链的延长 反应体系：DNA模板，DNA聚合酶，dNTP，引物，Mg2+反应式：DNA+dNTP→（DNA）n+1+ppiDNA 聚合酶：催化5‘→3’ DNA合成；3‘→5’外切酶活性：去除 错误碱基，有校对作用；5→3外切酶活性，去除RNA引物及修正错误碱基。 4、连接酶（ligase）：使相邻的DNA片段,以3,5磷酸二酯键相连，需ATP供能。 体外DNA合成 PCR-多聚酶链式反应 DNA聚合酶： 1、催化作用特点：高效 2、可以纯化分离 3、酶活力和纯度可以测定 4、条件满足，体外可以模拟（发生！） PCR反应的三个阶段 变性：反应模板形成单链模板，93℃-96 ℃。 复性：引物、探针与模板特异性结合，50 ℃ -68 ℃ 。 延伸：DNA合成（探针破坏，产生荧光），60 ℃ -75 ℃。 35-40 循环。 临床节约反应时间：复性和延伸合并一个温度。 典型反应条件举例 循环条件： 93℃→2分钟预变性， 93℃ 5秒→57℃ 45秒，做40个循环。 37℃1秒。 PCR反应体系 1. DNA模板 2. dNTPs 3.引物 4.taq 酶 5. mg2+ 6. 反应缓冲液（保持一定的PH值） 旧分析方法-定性：琼脂糖凝胶电泳法 荧光PCR 荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。 定义：当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。 TaqMan探针的结构 又叫水解探针 探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团R和一个淬灭荧光基团Q。 荧光基团R：吸收由激发光源发射的光波，发出的波长被淬灭基团Q吸收 淬灭荧光基团Q：也是一种荧光物质，吸收后发出的波长不再检测。接力棒的第二棒而已。 TaqMan PCR技术 荧光信号的累积 PCR扩增时，Taq酶的5－3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号 每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 PCR反应的特点 1、反应灵敏：放大的倍数惊人，10的5-8次方； 2、反应具有序列特异性 生物学意义：可以鉴别同样临床症状的不同病原体，用药参考。 PCR反应的数量特点 一次循环，PCR产物量－－2倍增加 一次循环， 荧光发射基团－－2倍增加 荧光信号的增加代表了PCR产物量的增加 实时荧光定量PCR技术 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。 PCR循环与定量 1、荧光背景信号阶段：扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。 2、平台期：扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。 3、指数期：只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。 荧光阈值和 CT 值 Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 荧光阈值 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 刚刚进入真正的对数期 标准曲线 浓度计算 荧光定量PCR仪器 美国ABI公司：7300,7500 美国ROCHE公司：LC2.0，LC480 达安7600,7600II 其他：Bio-rad， PCR的类型和应用 研究：基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断：细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程：遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医：犯罪现场标本分析 肿瘤：各种肿瘤检测 其他…… PCR产品 儿童呼吸道：MP,CP。。 肝炎系列：HBV,HCV,HAV,HEV,HGV。。 性病系列：UU,T