H2S作为分子探针的发展与应用.pptxVIP

H2S分子探针的部分研究介绍169940008张舒翼H2S概述早期（环境中的）现代（内源性）来源地质和微生物活动所自然产生1.哺乳动物细胞胞浆内：胱硫醚-β-合酶（CBS）或胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）催化分解含硫氨基酸L-半胱氨酸（L-Cys）2.线粒体内，天门冬氨酸氨基转移酶（CAT）催化L-半胱氨酸生成3-巯基丙酮酸，再由3-巯基丙酮酸硫转移酶（MST）脱硫产生H2S3.非酶反应：葡萄糖氧化代谢过程中产生的还原物质使硫元素转化为H2S（少量）。存在于神经系统、消化系统、心血管系统和呼吸系统等。性质无色可燃,散发臭鸡蛋气味的气体在生物体内可持续产生、传播迅速、快速扩散，是继NO和CO之后的第三种内源性气体信号分子对健康的影响刺激眼和呼吸道。吸入硫化氢过多会导致意识丧失,呼吸衰竭、心脏骤停,在极端的情况下,死亡。H2S水平不足：阿尔茨海默病等;重要器官中硫化氢的过度生产：糖尿病的发病机制。内源性气体信号分子NO、CO20世纪80年代中后期，一氧化氮（Nitricoxide，NO）这种简单的气体小分子被确认为内皮舒张因子，NO具有舒张血管、抑制血小板聚集和抑制细胞的增殖等多种效应，由此开创了气体信号分子这一崭新研究领域。内源性的NO主要由精氨酸在一氧化氮合酶作用下生成，在细胞内以可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）为受体，升高细胞内环磷鸟苷（cGMP）水平，发挥生物学效应。20世纪90年代中期，另一种被认为是毒性气体分子的一氧化碳（Carbonmonoxide,CO），也被证实是一种内源性气体信号分子。CO是血红素被血红素加氧酶代谢生成胆绿素过程中生成的。CO与可溶性鸟苷酸环化酶结合，可以激活该酶，引起细胞内cGMP水平升高，从而调节血管张力。CO生理作用包括学习和记忆过程、脊索神经痛觉传递、嗅觉受体神经的发育和功能、舒张血管、抑制平滑肌细胞增殖等功能。然而，CO的调节作用远低于NO。继NO、CO之后，硫化氢（Hydrogensulfide，H2S）被证实是存在于体内的第三种新型的内源性气体信号分子。一、内源性H2S在体内的活性形式两种形式：1.气体形式(1/3)2.可能是HS-(2/3)。HS-+H+=H2S处于动态的平衡。优点：1.保证了H2S在体内的稳定2.不改变内环境的pH值二、H2S的检测技术当前对硫化氢检测技术有比色法、电化学法,色谱法和硫化物沉淀。例：亚甲基蓝比色法：电化学分析法NathanS.Lawrence等[52]采用了碳纳米管改进的玻璃碳电极（CNT），这是一种对H2S的电解反应表现出稳定性的电极。与普通碳电极相比，采用碳纳米管改造的电极在硫化物氧化反应中过电压的条件下有较大的降低，CNT在检测H2S中具有高敏感性，低电位和稳定的电流敏感性。气相色谱分析法JulieFurne等采用气相色谱分析法测定组织器官中的H2S浓度，实验中很多样本的H2S浓度采用气相色谱仪测定，检测器为化学发光硫检测器，比较待测样品与标准品峰面积，可以确定H2S浓度。这些方法需要事后处理，造成活生物样品损害。因此,这些方法是破坏性和不适合监测原生生物中H2S环境的。相比之下,荧光成像技术提供了一个活细胞内研究生物分子的有吸引力的技术。三、硫化氢荧光探针例子：通过叠氮还原机理检测内源性H2SH2S选择性还原叠氮基团，产生荧光发光团，通过荧光分光光度计和酶标仪的分析，从而达到定量检测H2S的目的。（无荧光）（有荧光）2011年，美国加州大学伯克利分校ChristopherJ.Chang教授课题组，首先合成了SF-1和SF-2荧光探针如图：检测内源性H2S的机理是叠氮基团与H2S发生还原反应，产生高荧光性罗丹明产物，通过荧光分光光度计定量的检测内源性H2S的浓度。在活细胞中验证了荧光探针检测H2S的可能性。SF-1和SF-2荧光指示剂的动力学参数并不佳，荧光强度增加倍数也不大，SF-1探针存在多种活性物质选择性表现不好等诸多不足。重点来了！探究在活细胞内生物分子的研究原理：在生理的pH值,二硝基苯基l醚的硫解反应可能应用于生物学上丰富的谷胱甘肽和半胱氨酸中H2S的选择性检测。研究过程：一、评估NIR-H2S在缓冲水溶液中检测硫化氢的能力。硫氢化钠(硫化氢标准源）在50mMPBS缓冲溶液(pH值7.0)与3毫米十六烷基三甲基铵硝酸溴铵盐(CTAB)和10%乙醇中滴定NIR-H2S探针。释放的探针在缓冲溶液中实际上是无荧光的。图1不同浓度的硫氢化钠(0-40毫摩)下的水缓冲溶液中NIR-H2S(5.0毫摩)探针的荧光光谱。插图:在708nm下NIR-H2S(5.0毫摩)的探针与硫氢化钠的荧光强度比(F/F0)变化。激发光在650nm。发射光在708nm。实验结论：1.由图1看出：708nm处引入硫氢化钠引起显著的荧光刺激反应(18倍荧光增强)