生物离心-区带分离讲述.pptxVIP

区带离心法;原理：利用各种粒子的沉降速度和浮力密度差，当一定粒子到达与其密度相同的梯度位置时则停止沉降，不同粒子处于不同位置，则得到了分离。; A、速率区带离心： 速率区带离心法依据样品中各组分沉降速率的差别而使其互相分离。在离心管中灌制好预制的一种正密度梯度介质液，在其表面铺上一层样品溶液，离心期间，样品中各组分会按照它们各自的速率沉降，被分离成一系列的样品组分区带，故称速率区带离心。; 预制密度梯度介质的作用有二个，一是支撑样品，二是防止离心过程中产生的对流对已形成区带的破坏作用。但是样品液的密度一定要大于密度梯度介质的最大密度，否则就不能使样品各组分得到有效分离。 离心过程中，各组分的移动是相互独立的。因此，S值相差很小的组分也能得到很好的分离，这是差速离心法做不到的。但速率区带离心不适于大量制备实验。 ;B、等密度区带离心法 依据粒子本身的密度差异而进行分离。如果离心管中介质的密度梯度范围包括待分离样品中所有组分的密度，离心过程中各组分将逐步移至与它本身密度相同的地方形成区带，这种分离方法称为等密度梯度离心。 在等密度梯度离心中，组分的分离完全取决于组分之间的密度差。离心时间的延长或转速提高不会破坏已经形成的样品区带，也不会发生共沉现象。;（2）用自生梯度的等密度离心分离方法;特点：（1）与样品粒子的密度有关（2）与样品粒子的大小和其他参数无关 （3）转速、温度不变,则延长离心时间也 不改变这些粒子的成带位置。;速率区带离心与等密度梯度离心的区别！ 1、依据的原理不同 速率区带离心依据粒子的沉降速率被分离；等密度梯度离心依据粒子本身的密度差异被分离。 2、介质的梯度范围不同 速率区带离心介质的密度小于样品中各种粒子的密度；等密度梯度离心介质密度大于样品各种粒子的密度。 3、时间效应不同 速率区带离心不能长时间离心；等密度梯度离心长时间离心将各种粒子停留在等密度位置形成区带。;区带离心法样品的加入量：;密度梯度介质的选择： 1）梯度??质成份应该是惰性的； 2）梯度介质溶液的物理和化学特性应该知道； ; 甘油、多糖、碘化物、钠盐、钾盐、铷盐、铯盐、聚乙烯吡咯烷酮等。; ;分离区带的回收 ： 穿刺法 虹吸法 加压法 切割法 自动收集器 层层吸收法 ;; 将增溶后离心得到的类囊体膜（类囊体膜上存在着PSI单体和三聚体，以三聚体为主。）铺在10%-30%不连续的蔗糖密度梯度上，蔗糖密度由上至下依次为10%，15%，20%，25%，30%。所配制的蔗糖成分中分别含Triton X-100为0.05%（m/v）。4℃超速离心15h，160000×g，转子为P40ST。; 在PSI提取方法中，得不到较纯的PSI单体。所以，把增溶分散的PSI三体，通过挤出器，100nm的聚碳酸酯膜，反复挤出20次，通过蔗糖密度梯度离心，取出PSI单体条带，即得到PSI单体。;Thank you!