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R = Reporter (荧光报告染料) Q = Quencher (淬灭物) 当 TaqMan 探针完整时，荧光报告染料发射的荧光被淬灭物所淬灭。 在延伸反应中， 荧光报告染料被 DNA 聚合酶切除后与淬灭物分离，其荧光信号被检测。 荧光探针法 具有发夹结构的 Molecular Beacons 探针 只适合特定目标 设计困难 价格高 高特异性 荧光背景低 Molecular Beacon 法 价格高 只适合特定目标 特异性高 重复性好 TaqMan 法 引物要求高 易出现非特异性带 适用性广 灵敏 方便 便宜 SYBR Green I 法 缺点 优点 方法 几种方法的应用比较 plateau phase 阈值 (Threshold) 是在指数期适当位置设定的荧光检出界限值。 基线 (baseline) 是前15个循环的荧光信号本底。 扩增曲线 * PCR (聚合酶链式反应) PCR 是利用热稳定 DNA 聚合酶在体外快速扩增 (复制) 某一特定 DNA 片段的方法。 PCR 原理 Kary B. Mullis 1983 发明 PCR 技术 1993 获得诺贝尔化学奖 美国 Yellowstone 公园的热泉 嗜热水生细菌 (Thermus aquaticus) Taq DNA 聚合酶 PCR 过程 1. 模板变性 (Denaturation) 双链 DNA 模板在 95?C 变性为单链 DNA。 2. 引物退火 (Annealing) 引物与单链 DNA 互补并退火。 3. 延伸反应 (Extention) 耐热的 DNA 聚合酶催化子链的合成。 缓冲液 (Tris-HCl, KCl) MgCl2 或 MgSO4 DNA 模板 上游引物 (upstream primer, sense primer) 下游引物 (downstream primer, antisense primer) 底物 dNTPs 热稳定 DNA 聚合酶 PCR 反应体系 抑制 PCR 反应的物质 1. 长度： 18 - 24 个核苷酸； 2. G＋C ％ ：40 - 60％； 引物的设计 Tm = 69.3 + 0.41 (G + C%) 引物长度为 18 - 24 个碱基： Tm (?C) ＝ 4 (G＋C) ＋ 2 (A＋T) 5’ ATGGCGGGCAGGTCAGAAAG 3’ G＋C ＝ 12；A＋T ＝ 8 Tm ＝ 4 X 12 ＋ 2 X 8 ＝ 64?C 3. 四种碱基随机分布； 4. 引物自身不应存在互补序列，以防形成发夹结构； 5. 引物之间不应存在互补序列，以防形成二聚体 (dimer)； 引物的自身互补序列形成发夹结构 两个引物分子形成二聚体 6. 引物的 5’ 端可添加限制性内切酶识别位点，便于PCR 产物的定向克隆。 5’ CATATG 3’ 3’ TTCGAA 5’ NdeI HindIII http://primer3.ut.ee/ /primer3plus/ 无 3’A Thermus thermophilus Tth DNA 聚合酶 有 平端 Thermotoga maritima UITma DNA 聚合酶 有 平端 Pyrococcu sp. GB-D Deep Vent DNA 聚合酶 有 平端 Thermococcus litoralis Vent DNA 聚合酶 有 平端 Pyrococcu woesei Pwo DNA 聚合酶 有 平端 Pyrococcu furiosus Pfu DNA 聚合酶 有 平端 Thermococcus sp. KOD Pfx DNA聚合酶 无 3’A Thermus aquaticus Taq DNA 聚合酶 3’? 5’ 外切酶 活性 (校正) PCR产物 末端 来 源 DNA 聚合酶 常用的热稳定 DNA 聚合酶 待扩增片段：1000 bp 引物 Tm ＝ 55℃ DNA 模板变性: 94?C, 5分钟; PCR 循环 (30 次): 94?C, 30秒; 50?C, 30秒; 72?C, 1分钟; 最终延伸: 72?C, 7-10分钟 PCR 反应条件的设定 PCR 产物的检测 PCR 产物 PCR 产物 琼脂糖凝胶电泳 PCR 类型 标准 PCR 热起始 PCR (Hot-start PCR)：提高 PCR 反应的特异性 长 PCR (Long PCR)：PCR 产物 5 kb 巢式 PCR (Nested PCR) 反向 PCR (Inverse PCR) 菌落 PCR (Colony PCR)