微生物实验技术讲义.doc

开课编号：513041Y 微生物学实验技术 Experiment of Microbiology 课程编号：S071005ZY009 课程属性：专业课 学时/学分：60/1 预修课程：微生物学、生物化学、普通生物学、遗传学 教学目的和要求： 本课程为微生物学专业研究生专业课，也可作为相关专业研究生的选修课。通过本课程的教学，训练学生掌握微生物学的操作技能；进一步了解、深化微生物学的基本理论，加深理解课堂讲授的有关微生物学理论知识，同时通过实验，培养同学观察、思考、分析问题和辩证思维能力，为今后从事教学、科研和生产工作打下扎实基础。 实验一 微生物实验综合介绍（8h）（刘利新） 微生物学实验室安全操作规程讲解 本部分内容将参照《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》（WS233-2002）,该《准则》于2003年8月1日实施。规定了微生物和生物医学实验室生物安全防护的基本原则、实验室的分级及其基本要求。本节课将对其中内容进行选择性讲解，期望对新入实验室的学生规范化管理起到积极的促进作用。 微生物实验设备综合介绍 细菌、放线菌分离培养基的制备 为保证下节实验课的顺利进行，本次实验课将配制细菌、放线菌分离培养基。详细步骤参见实验二中培养基制备。 实验二 从自然界分离筛选微生物菌种（8h）（戴欣） 实验目的 实验原理 实验内容 细菌、放线菌分离培养基的制备 先在空烧瓶中加入所要配制总量的50%左右的水 称量培养基各组分 溶化各组分，如需要可搅拌或加热 调pH，定容 分装。如需配制固体培养基可加入1.5%琼脂粉 高压蒸汽灭菌：一般选择121℃/20min，但如果培养基中有葡萄糖类物质应选择115℃/20min。 R2A培养基（细菌用）： 酵母提取物：0.5g；蛋白胨：0.25g；酪氨酸：0.75g；葡萄糖：0.5g；淀粉：0.5g；磷酸氢二钾：0.3g；硫酸镁：0.024g；丙酮酸钠：0.3g；加水稀释至1L，调节pH至7.5-7.8，琼脂15g，115灭菌20分钟后倒平板； GYM培养基（放线菌用）： 酵母提取物：4g；麦芽糖：10g；葡萄糖：4g；碳酸钙：2g；加水稀释至1L，调节pH至7.5-7.8，琼脂15g，115灭菌20分钟后倒平板。 样品的采集和保存 微生物分离培养微生物菌株纯化与保存 将长出的菌株挑取在新的培养基上进行划线纯化，一般2-3次以上；将纯化后的菌株可转至试管斜面培养短期保藏，也可经液体培养后添加保护剂（甘油、二甲基亚砜、脱脂奶粉等）冻存。 纯化菌株的（分子）鉴定 16S rRNA基因通用引物16S rRNA通用引物 27F 5 AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3 1492R 5 TAC GGY TAC CTT GTT ACG AC 3 实验三 厌氧微生物的培养（8h）（佟卉春） 实验目的 熟练掌握微生物的厌氧培养方法；观察菌体、菌落形态特征，并测定其生长曲线。 实验原理 厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。?目前培养厌氧微生物的技术包括：亨盖特厌氧滚管技术，厌氧手套箱培养技术，及厌氧罐/袋培养技术。 试剂与器材 ：试剂 实验内容 以链球菌为例，进行纯度检查，厌氧培养及生长曲线测定。 纯度检查：涂片、革兰氏染色、及显微镜下观察细菌形态及纯度。接种及厌氧培养： 1）预还原无氧培养基制备（演示）：培养基配制；分装，3ml/管；抽气换气法制造厌氧环境：先用真空泵抽成负压99.99kPa（750mmHg），然后充入无氧氮气，反复4次，最后充入80%N2、10%H2和10%CO2的混合气体；高压蒸汽灭菌。 2）接种及厌氧培养：将过夜培养的链球菌以1：20的比例接种到新鲜的预还原的厌氧培养基中，37温箱培养，每隔1小时取1ml样品，用分光光度计测定其在600nm处的光吸收值，记录并绘制生长曲线。Hungate厌氧滚管 1）实验菌种系列稀释：将实验菌种10倍系列稀释。用无菌注射器吸取1ml?原液至另一支装有9ml培养基的试管中，制成10-2稀释液。按此操作方法依次进行10倍系列稀释，制成不同浓度的样品稀释液。取适宜稀释度的样品进行厌氧滚管。 2）厌氧滚管：?将预先配制的装有2.7ml无氧琼脂培养基的试管置于沸水中融化，放置于55左右的恒温水浴中，用1ml无菌注射器分别吸取适宜稀释度的稀释液各0.3ml于融化了的琼脂培养基试管中，而后将其平放于盛有冰块的盘中迅速滚动，培养基在试管内壁立即凝固成一薄层。 2）37温箱培养，24小时后观察并记录菌落形态。 厌氧罐培养 1）实验菌种系列稀释：将实验菌种10倍系列稀释，取适宜稀释度的样品涂布平板。 2）将平板置于厌氧罐中，厌