6.基因组编辑技术专题.pptVIP

Di Fan Nov. 12th, 2015 ZFN=蛋白的DNA识别域+核酸内切酶 DNA识别域： 由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般3~4个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。 典型的 TALEN由一个包含核定位信号（NLS）的N端结构域、一个包含可识别特定 DNA序列的典型串联TALE重复序列的中央结构域，以及一个具有FokI核酸内切酶功能的C端结构域组成。 DNA识别域：由一系列TAL蛋白串联组成（一般20个左右），每个TAL蛋白识 别并结合一个对应的碱基。 核酸内切酶： 非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA TALEN质粒对共转入细胞后，表达两个融合蛋白，分别与靶位点特异结合，由于两个TALEN融合蛋白中的Fok I临近，形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA。 形成DSB时，同源重组可将需要敲入的序列组合入基因组。 目前不清楚向导RNA分子的特异性作用机 脱靶效应（off-target effect）。Joung的工作显示，与向导RNA序列类似的非靶点DNA片段也能够被切断、激活或 者失活，即存在明显的脱靶效应。 新方法解决CRISPR-Cas系统难点 可减弱甚至消除消除脱靶效应 利用计算机模型。 调整导向RNA序列的量 计算高目标效应和低脱靶效应间最优平衡点 必威体育精装版研究表明，增长RNA链可以提高RNA的结合效率。所以张峰教授对RNA片段结构进行优化，包含一段稳定的发卡结构，能更有效的引导Cas9发挥作用 2 Type?II?CRISPR系统—Cas9 随着越来越多的不同菌中的CRISPR系统被发现，研究者们根据他们降解外源的遗传物质的方法，将他们分为了三类。 Type?I?and?Type?III.?这两套系统由于参与的蛋白众多，需要几个复合物共同作用才能发挥作用，使得它不宜操作和改造。 PAM: proto-spacer adjacent motifs(保守的间隔相邻基序) crRNA: CRISPR RNA tracrRNA: trans-activating CRISPR RNA 3.人工改造 ? Type?II?CRISPR系统中的Cas9是个核酸酶，这个核酸酶结合两个RNA(crRNA,?tracrRNA)就可以切割双链DNA.? 3.人工改造 ? 他们进一步阐明了RNA和目标DNA配对的原则，同时将crRNA-tracrRNA连接成了chimera?RNA，这样只需要Cas9蛋白和一条定制的RNA就可以编辑特性的DNA。 2012年Jennifer?A.?Doudna和Emmanuelle?Charpentier的这篇Science发现了一个比较简单的CRISPR（TypeII）系统的机理。这一系统就简单多了，一个巨大的160KD的蛋白Cas9利用RNA,?就可以完成识别和切割靶向的DNA。 3.人工改造 他们进一步分析了Cas9作为核酸酶的活性位点：两个核酸酶活性域会分别切割靶DNA的两条链，造成双链断裂。 Nucl. Acids Res.-2013-DiCarlo-nar_gkt135 Cas9 gRNA 20 nt 4.工作原理 Cas9蛋白与向导RNA结合、组装的动作是这套位点特异性的基因组修饰过程里的限速步骤。 真核系统的应用 1）??优化密码子，让Cas9蛋白可以在哺乳动物系统中很好的表达。 ?2）??加了核定位序列(NLS)，这样可以把Cas9送到细胞核内进行基因组编辑。? 3）??当然，同时需要表达一个guide?RNA，把Cas9定位到靶DNA处。 4）??CRISPR-Cas系统靶向要求为PAM序列（5’-NGG-3’），即靶序列后面必须为NGG才能被向导RNA识别，在人类基因组中平均每8个碱基就可以出现一个NGG。 利用这个技术，就可以很方便高效廉价地在细胞上做基因编辑：包括敲除、修改、插入。 4.工作原理 4.工作原理-切割后的处理 NHEJ : Non-homologous end joining 非同源性末端接合 HDR: Homology-direct repair 同源直接修复 进一步用Nickase增加编辑特异性 因为Cas9介导的靶向主要依赖于guide?RNA和目标DNA20左右的碱基的配对，大家开始重视脱靶效应（off-target）。 Zhang Feng MIT PKU 很快，MIT的张峰在Cell上发表了Double?Nick的方法。 Cas9会在目标DNA上切两刀，如果把其中一个核酸酶活性位点突变掉，它就变成了一个切口酶。用两对这样的sgRNA把这种切口酶带到基因组上的特异位点