亚细胞核的分离和鉴定.docVIP

亚细胞核的分离和鉴定 关键词：细胞 试剂 试剂盒 甲苯胺蓝 试剂 标准物质 北京标准物质网 1、细胞核的分离? 细胞核作为一个功能单位，完整地保存遗传物质，并指导RNA合成，进而表达出相应的蛋白，在一定程度上细胞核控制着细胞的代谢、生长、分化和繁殖活动。因此细胞核的分离是研究基因表达及细胞核形态结构的首要步骤。不同组织来源的细胞经匀浆后，可用分级离心等方法将细胞核进行分离纯化。 细胞核的分离目前较常采用以蔗糖为介质的差速离心法，可分为细胞核分离和纯化两大步骤。细胞匀浆后，先以0. 25mol／L。的蔗糖1000g离心洗涤，然后在0. 34mol／L和0．88mol／L的蔗糖梯度中1500g离心15～20分钟，沉淀即为纯化的细胞核。现在细胞核的提取试剂已商业化生产，公司试剂盒中会提供详细的操作步骤。细胞核被分离后，可经甲苯胺蓝染色在光学显微镜下观察，或直接在电子显微镜下观察核内染色质的分布情况。 2、细胞核的鉴定 (1)光镜直接观察：普通光学显微镜下，贴壁细胞的细胞核为位于细胞中央的一团较深物质，悬浮细胞会显得更模糊，且都无法清晰分辨细胞核与细胞质。常用于细胞核的化学染料包括甲紫、苏木精、醋酸洋红、甲基绿等。苏木精．伊红染色简称HE染色，是组织学、胚胎学和病理学最常用最基本的细胞核细胞质染色方法，细胞核嗜碱被苏木精染成蓝色(图5-3-1)。 (2)电镜观察：电镜能清晰地观察到细胞核基质的基本形态，以及核膜、核仁、核染色质等，所以可以被应用到细胞核的可视化研究中。比如细胞凋亡，电镜下清晰可见，核基质由结构完整到出现紊乱，到凋亡小体的形成并由核内排出。因此，电镜扫描可以清晰展示出细胞核的各个阶段的状态，能更形象化地应用于细胞核功能学、发育学以及细胞凋亡等研究中(图5-3-2)。 (3)细胞学鉴定：核酸荧光染色后，可采用荧光显微镜、共聚焦激光扫描荧光显微镜以及流式细胞仪检测。常用的三大经典核酸染料包括：插入性染料，如：ethidium bromide(EB)和propidiumiodide(PI)；DNA小沟结台染料，如：DAPI和Hoechst：以及其他类核酸染料，如：吖啶橙、7-AAD、LDS751等。 DAPI是一种具有膜通透性的强力DNA荧光染料，可用于活细胞以及死细胞的细胞核染色。荧光显微镜下，DAPI可被紫外光激发出蓝色荧光，其荧光激发光358nm以及发射光461nm。因为彼此的发射光很少重叠，DAPI通常与绿色荧光(如GFP)和红色荧光(如RFP)结合，三者被用于细胞的多重荧光染色(图5-3-3)。Hoechst染料常用的有Hoechst 33258和Hoechst 33342，其激发光和发射光与DAPI非常相似，都可用于活细胞和固定细胞的标记。DAPI和Hoechst染料是科研人员最常使用的用于细胞核标记的荧光染料。 此外，在细胞增殖的研究中，人们常常将Brdu／Edu等底物掺入到增殖的细胞核DNA链中，再通过荧光素标记Brdu/Edu，继而显色增殖细胞的细胞核。在细胞凋亡研究中，人们常采用TUNEL染色标记凋亡细胞的细胞核。 由于三维重建等优点，共聚焦显微镜在细胞成像技术中的地位逐渐突出。：DAPI虽然常用，但是多数共聚焦显微镜没有紫外线波段的激发光，所以其他一系列更适用于共聚焦的核酸荧光染料被开发出来，比如TOTO系列，TO-PRO系列，SYTOX系列以及SYTO系列等。 3、方法优缺点比较与选择? 细胞核检测较少采用细胞免疫荧光或原位免疫组化的检测方法，而普遍采用荧光染料与核酸物质直接结合而显色。组织染色中，细胞核的常规光镜观察优先选择苏木精染色，简单方便，普通光镜就能得到胞质区别明显的组织切片图片，但分辨率差，常常仅限于低倍镜下观看，且细胞核轮廓不清晰，染色特异性差。 在多重细胞荧光染色时，DAPI和Hoechst染色为核酸染色首选，活细胞以及固定后的细胞上都可以得到特异性的细胞核成像，且轮廓清晰，染色高效快捷，由紫外光激发，与其他常用激发波段的波长基本不重叠。但DAPI为半透膜染料，组织核酸标记并不理想，并且其紫外激发波段也不适用于所有共聚焦显微镜。 TOTO和TO-PRO等系列的核酸荧光染料常常用于共聚焦显微镜细胞成像，并且远红外激发波段的染料更常见。远红外波段可以和其他可见光荧光染料组合，进行多重荧光细胞成像，缺点在于普通荧光显微镜无法观测到。 电镜观察细胞核多数用于细胞凋亡或者其他细胞功能学的可视化研究中，为其提供进一步的图像证据。