基因工程原理 第10章 动物细胞的基因转移.pptVIP

近年来，研究人员成功开发了一种快速、高效产生重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcNPV）的技术（Luckow et al., 1993），利用细菌转座子原理，在大肠杆菌内就能完成重组病毒的构建，取名为Bac-to-Bac表达系统，意即从细菌（bacterium）到杆状病毒（baculovirus），革命性地改变了重组昆虫杆状病毒的构建方法。 其基本原理为：将一个改造后的AcNPV基因组转化入大肠杆菌，使它像普通质粒一样能在细菌中复制（由于太大，只限单拷贝），将其称之为杆状病毒穿梭载体（baculovirus shuttle vector，又称病毒质粒 baculovirus plasmid，将其首尾合写而成为Bacmid），通过位点特异性转座，在大肠杆菌内完成病毒基因组的重组。杆状病毒穿梭载体Bacmid含有细菌单拷贝数mini-F复制子、卡那霉素抗性选择标记基因及编码β-半乳糖苷酶α肽的部分DNA片段 在lacZα基因的N氨基末端插入一小段含有细菌转座子Tn7整合所需的靶位点（mini-att Tn7），但它的插入不影响lacZα基因的表达阅读框。将杆状病毒穿梭载体（130kb）转化入大肠杆菌DH10β,获得转化子将其命名为DH10Bac。因此，杆状病毒穿梭载体像一个大质粒一样，可以在大肠杆菌中增殖并使细菌细胞获得卡那霉素抗性，且与存在与受体菌染色体上的lacZα缺失产生互补，在IPTG诱导和X-gal或Blue-gal生色底物存在下转化体产生蓝斑（lacZ+）。 重组Bacmid通过pFASTBAC供体质粒（donor plasmid）上的mini-Tn7转座子，在另一个辅助质粒（helper plasmid，13.2kb）的功能作用下将外源目的基因插入到Bacmid中来完成。Helper plasmid表达转座酶并含有四环素（tetracycline）抗性基因。pFASTBAC系列供体质粒具有共同的特征：每个质粒都含有杆状病毒启动子（polh或p10启动子），在mini-Tn7左右臂间由一个完整的表达框，包括庆大霉素（gentamincin）抗性基因、杆状病毒启动子、多克隆位点及SV40 poly(A)。外源基因插入到杆状病毒启动子下游的多克隆位点，将此重组的供体质粒转化入含还有helper plasmid和Bacmid的DH10Bac中，由mini-Tn7转座子将供体质粒上的表达框插入到Bacmid的靶位点，破坏lacZα基因的表达。在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素和X-gal的培养板进行筛选，重组的Bacmid（即重组病毒基因组）转化体菌落呈白色。而非重组Bacmid转化菌落依然为蓝色。因此可以通过菌落的颜色进行重组病毒的筛选。通过单菌斑的培养，抽提得到重组Bacmid基因，随后转染入昆虫培养细胞获得重组病毒，即可进行重组蛋白的表达生产。 利用位点特异性转座作用将外源基因插入到能在大肠杆菌增殖的穿梭载体Bacmid，实现重组病毒的构建，该方法的优点在于：（1）由于重组病毒的分离是通过蓝白斑筛选，不存在野生型和非重组型病毒污染的问题，因此不需要传统繁琐的空斑分析来纯化重组病毒；（2）大大地缩短了重组病毒构建所需要的时间。因此，该技术可以快速、同时分离多种重组病毒。这是一种目前最快速简捷地生产重组病毒的方法。目前，Invitrogen公司已有AcNPV表达系统的Bac-to-Bac系列产品。 * * 包含内含子通常会增强表达。 5‘UTR和3’UTR都能通过很多途径影响基因的表达。 在翻译起始位点附近的序列应该和Kozak保守序列一致，这一序列为：5‘-CCRCCAUGG3’. * * BPV载体 * EBP载体 * 腺病毒 DNA病毒，基因组大约36kb 6个早期转录子，1个主要的后期转录子 稳定性、外源DNA高容量、宿主范围广、高滴度后代 * 腺病毒相关载体 AAV 单链DNA病毒 对异源辅助病毒有依赖性 AAV载体已用于将基因高效转入许多类型的细胞 * 杆状病毒 杆状病毒具有杆状的衣壳和大的dsDNA基因组 感染许多节肢动物，特别是昆虫。 主要用于在昆虫和昆虫细胞内的高水平瞬时蛋白表达 AcMNPV和BmNPV sf9，sf21 家蚕活体 * * * * 动物细胞中高水平表达外源基因的载体设计 强组成型启动子的使用 包含内含子 包含poly A 去掉冗余的非翻译序列 提高外源基因翻译效率 整合一个靶信号 * * 动物细胞利于生产重组动物蛋白，因为动物细胞可以进行细菌和真菌所无法进行的真正的翻译后修饰。 本章集中阐述了体细胞的DNA转入。与植物的情况不同的是，大多数动物细胞在发育能力上都受到限制，因此不能用于产生转基因动物。小鼠胚胎干细胞(ES细胞)在这方面是个例外，因为它们取自种系形成之前的早