荧光定量PCR检测技术程序.pptVIP

荧光定量PCR检测技术 实时荧光定量PCR技术 所谓real-time FQ-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 是一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂交技术相结合的定量PCR方法。 PCR的高效扩增特性 核酸探针的高特异性 光谱技术的高灵敏性和可计量性 实时荧光定量PCR 定义 利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控 目的 对起始模板进行定量 优点 灵敏，重复性，动态范围宽，高通量 原理 Ct 值与起始模板浓度的对数成比例 实时荧光定量PCR原理 PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。 在传统的PCR 中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。 利用电泳定量 实时荧光定量PCR原理 在real-time Q-PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。 实时荧光定量PCR原理 在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点 上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。 实时荧光定量PCR原理 为了便于对所检测样本进行比较，在real-time Q-PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值（threshold）。 以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 （baseline），荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。 threshold = 10 acute; SDcycle 6-15  实时荧光定量PCR原理 如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数（Ct）。 Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。 什么是C(t)值 为什么要引入C(t)值 实时荧光定量PCR原理 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。 实时荧光定量 实时荧光定量PCR原理 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 如何定量 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。 荧光探针：TaqMan荧光探针 荧光染料：SYBR荧光染料 一、TaqMan检测技术原理 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，与扩增片断内部某一段系列相同或互补，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 TaqMan检测技术原理示意图 PCR扩增前 PCR扩增时 TaqMan检测技术的设计 与普通PCR的设计基本相同，区别在于引物与探针的设计一般需要特定的软件，如美国ABI公司开发的Primer Express软件。 （一）选择靶基因 TaqMan技术主要用于检测，所以其扩增的基因必须是特异的，如： 某种病原微生物所共有的保守基因 （检测某种病原微生物）； 某个血清型所特有的基因序列 （区分检测某个血清型）； 选择决定毒力强弱的基因 （区分强毒和弱毒）等。 （二）选择探针 选择探针需要同时满足以下条件： 1、在靶基因的保守区域 2、G+C含量在40%以上； 3、相同碱基连续不超过4个； 4、Tm值在71±2℃; （二）选择探针 5、内部自身配对较少； 6、5’端不为G； 7、G数目比C数目少； 如果6和7难以满足的时候，就要考虑用互补序列作探针。 （三）选择引物 探针选好之后，在探针的上下游分别选择合适的引物序列，引物应满足如下的条件: 1、在靶基因保守和无二级结构的区域； 2、与探针所在区域不重叠； （三）选择引物 3、与靶基因其他区域配对较少； 4、G+C含量在40%以上； 5、相同碱基连续不超过4个； 6、Tm值比探针Tm值低10±1℃; （三）选择引物 7、探针与两条引物之间的各种组合形成的二聚