流式细胞术原理及应用分析.pptVIP

什么是荧光补偿？纠正荧光素发射光谱重叠 为什么要进行补偿调节？ 520 400 500 600 700 575 665 FITC PE PC5 laser D、 单标对照 Single Staining Control 补偿调节方法： FL-1(FITC) FL-2(PE) FL-1(FITC) FL-2(PE) FL2 - %FL1 FL-1(FITC) FL-2(-) FL-1(-) FL-2(PE) FL1 - %FL2 Before Compensation After Compensation FITC 单标 PE 单标 什么样的补偿最合适？ 单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光Median值相等时为最合适的补偿。 Uncompensated Compensated FL1-FITC stain FL2-no stain FL1-FITC stain PE-Medianneg PE-Medianpos PE-Medianneg= PE-Medianpos PE-Medianneg PE-Medianpos FL1-FITC stain Overcompensated 准确补偿的重要性 补偿调节要合适 未补偿 正确补偿 FITC-PE补偿太大 PE-FITC补偿太大 使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别染色 n色分析就要制备n 个补偿对照管 举例：双染实验 设门与数据分析 门(Gate，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。 流式结果 十字门 线性门 黏附因子 表面受体 细胞因子 分泌到胞外的细胞因子 胞内抗原 核酸含量 核内抗原 细胞功能 细胞表面、胞浆、核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 细胞受体 细胞内钙离子 流式细胞仪检测范围 HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病 医学应用 科研应用 在免疫学研究中的应用: 鉴定免疫细胞类型 抗原特异性T细胞研究 细胞因子分泌细胞研究 全血细胞研究 凋亡检测 细胞增殖检测 干细胞向免疫细胞分化的研究 转染荧光蛋白细胞系研究 稀有细胞检测 。。。 在神经生物学研究中的应用： 神经干细胞和神经祖细胞的特性研究； 不同类型的神经细胞的鉴定和功能研究； 星形胶质细胞和胶质细胞的鉴定和功能研究； 检测细胞活性，细胞凋亡和细胞周期； 神经细胞发育过程研究 干细胞向神经细胞分化研究 。。。 在肿瘤研究中的应用： 细胞凋亡的检测； 细胞周期分析； 细胞增殖研究； 荧光蛋白分析； 肿瘤干细胞的鉴定和功能分析； 循环肿瘤细胞的鉴定和功能分析； 实体瘤细胞的检测分析（肿瘤组织解离成单细胞后）； 肿瘤细胞系表型分析； 细胞活性的检测； 。。。 在细胞生物学和分子生物学研究中的应用： 检测细胞转染效率； 检测转导效率； 分析细胞中荧光蛋白的表达； 分析蛋白—蛋白之间的相互作用（FRET） 分析细胞活性，细胞凋亡，和细胞周期； 研究细胞的分化过程； 研究细胞增殖； 。。。 在高通量检测和新药研发中的应用： 细胞功能变化的研究； 细胞周期和活性； 细胞凋亡； 细胞增殖； 新药研发； 培养基研发； 。。。 海洋生物学 富集和分析细菌，藻类，浮游植物等 微生物学 细菌和酵母检测； 荧光蛋白检测。 生物燃料 Bodipy?和/或 Nile Red中脂类的定量 藻类，蓝藻细菌，酵母和细菌等生物的富集 4.1 细胞周期检测 处于不同细胞周期的细胞DNA含量不同，G0/G1期细胞含有二倍体量的DNA，G2/M期细胞含有四倍体量的DNA，而S期细胞DNA含量处于二倍体和四倍体量之间。 DNA荧光染料能与DNA结合，DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度反应了DNA吸收荧光分子的多少。通过流式检测就能反映细胞内DNA的含量，区分细胞周期的G0/G1期、S期和G2/M期细胞比例。 四、常见流式细胞术应用 细胞周期分析核酸染料 细胞膜非通透性染料：PI(碘化丙啶)、EB(溴化乙啶)，不能进入完整细胞膜，标记时需要通过固定等方法增加细胞膜的通透性。 细胞膜通透性染料：Hoechst、DPAI等能染活细胞的DNA，但需紫外激光激发。 PI标记法检测细胞周期 需要乙醇固定增加细胞膜的通透性； 需要加RNase，去除RNA对DNA的干扰。 PI法检测细胞周期一般步骤： 收集单细胞悬液(1 ×106个)，缓慢加入1 ml预冷的70％乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定。 离心收集细胞，再以1ml PBS彻底洗去乙醇； 去