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动物组织中核酸的提取与鉴定 内蒙古农业大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 制作人：王瑞刚 * 实验原理 实验试剂 实验步骤 * 实验原理 动物组织细胞中的核糖核酸 RNA 与脱氧核糖核酸 DNA 大部分与蛋白质结合形成核蛋白。可用三氯醋酸沉淀出核蛋白，并用95%乙醇加热除去附着在沉淀上的脂类 杂质。然后用10%氯化钠从核蛋白中分离出核酸 钠盐形 式 ，此核酸钠盐，加入乙醇可以被沉淀析出。 析出的核酸 DNA与RNA 均由单核苷酸组成，在单核苷酸中含有磷酸、有机碱 嘌呤与嘧啶 或戊糖 核糖、脱氧核糖 。核酸用硫酸水解后，即可游离出这三类物质。用下述方法可分别鉴定出这三类物质： * 1．磷酸：用钼酸铵与之作用可生成磷钼酸，磷钼酸可被氨 基奈酚磺酸还原形成蓝色钼蓝。 2．嘌呤碱：用硝酸银与之反应生成灰褐色的絮状嘌呤银化 合物。 3．戊糖 1 核糖：用硫酸使之生成糠醛，糠醛与3,5-二羟甲苯缩合 而成为一绿色化合物： 2 脱氧核糖在硫酸作用下生成β,ω-羟基-γ-酮基戊糖，后 者与二苯胺作用生成蓝色化合物： * 实验试剂 1．钼酸铵试剂 ：钼酸铵2.5g溶于20mI蒸馏水中，再加入5mol/L硫酸 30ml，用蒸馏水稀释1OOml。 2．氨基奈酚磺酸 ：商品氨基奈酚磺酸 1，2，4-Amino- naphthol Sulfonic Acid 为暗灰色。用下法提纯后使用:在100ml 蒸馏水中 90℃ 溶解15g亚硫酸氢钠及1g亚硫酸钠， 加入1.5g商品氨基奈酚磺酸，搅拌使大部分溶解 仅 少量杂质不溶解 ，趁热过滤，再迅速使滤液冷却。 加入lml浓盐酸，则有白色氨基奈酚磺酸沉淀析出。 过滤并洗涤固体数次。再用乙醇洗涤直到纯白色为 止。最后用乙醚洗涤，并将固体放在暗处，使乙醚挥 发。将此提纯的氨基奈酚磺酸保存于棕色瓶中备用。 * 氨基奈酚磺酸溶液配制：取195ml的15%亚硫酸氢钠溶液 溶液必须透 明 加入0.5g提纯的氨基奈酚磺酸及20%亚硫酸钠溶液5ml。并在热水 浴中搅拌使固体溶解 如不能全部溶解，可再加20%亚硫酸钠溶液，每 次数滴，但加入量以lml为限度 。此为浓溶液。置冰箱可保存2-3周，如颜色变黄时，须重新配制。临用前，将上述浓溶液以蒸馏水稀释10倍。 3、3，5-二羟甲苯溶液取密度1.19的盐酸100ml，加入六水氯化铁 100mg及二羟甲苯100mg，混匀溶解后，置于棕色瓶中。此试剂宜 在临用前新配制。市售的3，5-二羟甲苯若不纯必须用苯重结晶一、 二次，并用活性碳脱色方可使用。 4．二苯胺试剂：取1g纯的二苯胺溶于100m1重蒸馏的冰乙酸中 或分析 纯冰乙酸 ，加入2.75ml浓硫酸，摇匀。放在棕色瓶中保 存。此试剂需临用时配制。 5． 0.9%Nacl。 6． 20%三氯醋酸。 7． 95%乙醇。 * 实验步骤 一 匀浆制备 称取新鲜猪肝 或大白鼠肝脏 5克，加入等量冰冷的 0.9%NaCl溶液（可先放少量，待研磨成匀浆后加入剩余 部分），及时剪碎。放人研钵中加入少量石英砂，研磨成 匀浆。研磨过程中，要随时将研钵置于冰中冷却。（匀浆制备一定要在低温条件下制作，操作要迅速，以避免核酸 分解。） * 二 分离提取 1．将匀浆5m1置于离心管内，立即加入20%三氯醋酸5ml，用玻棒搅 匀，静3min后，以3000r/min离心l0min。 2．倾去上清液，沉淀中加入95%乙醇5m1，用玻棒搅匀。用一个装 有长玻璃管的木塞塞紧离心管口，在沸水浴中加热至沸，回馏 2min。 注意乙醇沸腾后将火关小，以免乙醇蒸气燃烧。冷却后2500r/min 离心l0min。（脱脂） 3．倾去上层乙醇。将离心管倒置于滤纸上，使乙醇倒干。沉淀中加入 10%氯化钠溶液4ml，置沸水浴中加热8 min ，并用玻棒搅拌。取 出待冷却以2500r/min离心l0min 。 4．将上层清液量取体积后倾人一小烧杯内。若不清亮可重复离心一 次。 5．取等量在冰浴中冷却的95%乙醇（在冰箱中），逐滴加入小烧杯 内。即可看见白色沉淀析出。静置l0min后，转人离心管 3000/min，离心10min，即可得核酸的白色钠盐沉淀。 * （四）DNA与RNA成分的鉴定 1．磷酸的鉴定 取试管2支，按表操作 管号 水解液 5%硫酸 钼酸铵试剂 氨基奈酚磺酸 测定 对照 10滴 — — 10滴 5滴 5滴 20滴 20滴 * 2．嘌呤碱的鉴定:取试管2艾，按表操作 管号 水解液 5%硫酸 浓氨水 5%AgNO3 测定 对照 20滴 — — 20滴 数滴使呈碱性 数滴使呈碱性 10滴 10滴 * 3．核糖的鉴定 取试管2支，按表操作 将2支试管放入沸水浴内加热10min 管号 水解液 5%硫酸 3，5二羟甲苯试剂 测定 对照 4滴 — —