基因工程和食品产业.ppt

常用的受体细胞以细菌为主，其中主要有大肠杆菌、枯草杆菌 重组DNA导入受体细胞的方法有： （1）转化：是将重组质粒DNA导入受体细胞，使受体遗传性状发生改变的方法； 转化是使重组体DNA分子在热休克的短暂时间内被导入受体。热休克后将受体菌在不含抗生素的培养液中生长至少30分钟以上，使其蛋白得到足够表达，以便能在含抗生素的琼脂培养平板上生长。由于E.coliX1776菌株用CaCl2处理后制备的感受态细胞长期冷藏仍能保持其摄取外源DNA的能力，故常用作受体菌。 （2）转染：是指噬菌体、病毒、或以其为载体构建的重组DNA导入细胞的过程。 (其中又分磷酸钙沉淀法与体外包装法) 磷酸钙沉淀法?? 利用磷酸钙-DNA共沉淀，把外源基因与λ噬菌体DNA的重组分子导入大肠杆菌和哺乳动物细胞，简称磷酸钙沉淀法。细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA的能力，几乎所有的双链DNA都可以通过这种方法导入细胞，而且可在电子显微镜下清楚地看到细胞吞噬DNA-磷酸钙复合颗粒。此法的转染效率远远不如体外包装法。 体外包装转染法 ? 体外包装：指在体外将重组DNA放置到噬菌体的蛋白质外壳里，然后通过正常的噬菌体感染过程，将它们导入宿主细胞。将重组DNA噬菌体包装成噬菌体颗粒，使其能够感染细菌，并在宿主菌体内扩增和表达外源基因。 （2）转染：是指噬菌体、病毒、或以其为载体构建的重组DNA导入细胞的过程。 (其中又分磷酸钙沉淀法与体外包装法) 又称之为直接显微注射。一般是用微吸管吸取供体DNA溶液，在显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将DNA注射进去。此法常用于转基因动物的基因转移。 （3）微注射技术：是将外源基因直接注射到真核细胞内的方法； （4）电转化法 也有人称做高压电穿孔法（简称电穿孔法），即在受体细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，使质膜形成纳米大小的微孔，DNA能直接通过这些微孔，或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布而进入细胞质中。 该法可用于真核细胞(如动物细胞和植物细胞)和原核细胞(转化大肠杆菌和其他细菌等)的外源DNA的直接导入。??? ?电穿孔法具有简便、快速、效率高等优点 又称高速微型子弹射击法、微弹射击法、高速粒子轰击法 基本原理：将DNA吸附在微型子弹(1μm)的表面通过放电或机械加速，使子弹射入完整的细胞或组织内。 基本做法：先将外源DNA溶液与钨、金等金属微粒(直径0.5-5μm )共同保温，使DNA吸附于金属颗粒表面，然后放电加速金属颗粒，使之以400m/s的速度直接喷射受体细胞，外源遗传物质随金属颗粒进入细胞内部。 （5）基因枪技术 （6）脂质体介导法 （7）其他方法： 很多高效的新颖的导入方法，如加速冷冻法、碳化硅纤维介导法等正在研究并逐渐达到实用水平。 ???脂质体(又叫做人工膜泡)作为体内或体外输送载体的方法，一般都需要将DNA或RNA包囊于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜的融合，通过融合导入细胞。 受体细胞：也叫宿主细胞，是指在转化、转导、杂交中接受外源基因的细胞。 分为原核受体细胞(最主要是大肠杆菌)、真核受体细胞 (最主要是酵母菌)、动物细胞和昆虫细胞(其实也是真核受体细胞)。 具有接受外源DNA的能力；为限制性内切酶缺陷型菌珠或为DNA重组型菌珠 ；在标记上和载体对应；有利于表达；不适宜在人体或非培养条件下生存，有利于安全。 大肠杆菌是目前基因工程中最常用的受体细胞。通常采用的是大肠杆菌的感受态细胞，即在冰浴中用一定浓度的CaCl2处理对数生长期的大肠杆菌，以获得高效转化的感受态细胞。也有采用Rb+、Mn2+、K+、二甲亚矾、二硫苏糖醇(DTT)或用氯化己胺钴处理制备感受态细胞。 感受态是指受体细胞能吸收外源DNA分子而有效地作为转化受体的某些生理状态。一般受体细胞在对数生长期转化能力最强。 四、重组体的筛选与外源基因的鉴定 （一）重组体的筛选 基因克隆的下一道工序是：从转化细菌菌落中筛选含有阳性重组DNA分子的菌落，并鉴定重组DNA分子的正确性。 1、针对遗传表型筛选 按载体的性状变化进行筛选 根据插入基因的遗传性状进行筛选。 2、根据重组子的结构特征筛选 快速裂解菌落，鉴定分子大小 内切酶图谱鉴定 PCR筛选重组子 核酸分子杂交 （二）?重组体的鉴定 经过转化的重组体，如转基因微生物、转基因动物和转基因植物细胞，经过培养在其形成了一定的菌株、品系之后，就需要对它们进行鉴定，检验它们在生长发育、传种接代过程中是否保留了已获得的外源基因。?????? 1、?报告基因的检测法?? ??是一种快速而简易地区分转基因生物和非转基因生物的方法。 报告基因检测法：指在构建目的基因时将一种报告基因(如GUS基因)构建在一起，当