苜蓿愈伤组织的诱导与抗逆性突变体的筛选-中国畜牧业信息网.docVIP

苜蓿愈伤组织的诱导与抗逆性突变体的筛选 李波1 李红2 白庆武1 王秀丽 付园园1 （齐齐哈尔大学生命科学与工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 1610061） （黑龙江省畜牧研究所，黑龙江，齐齐哈尔1610002） 摘要：对准格尔苜蓿进行了愈伤组织诱导的筛选，在MS的不同激素培养基中，2.4-D 1、6-BA 0.5为最佳激素配比；并以硫酸二乙酯（DES）和低温对苜蓿愈伤组织进行诱变处理，筛选其半致死浓度（DES处理1.5h 为2.8%;2h为2.2%）和半致死温度为-5℃，并对诱变处理后的材料进行了脯氨酸含量测定，脯氨酸含量明显高于对照，筛选出了具有抗性的苜蓿愈伤组织，为苜蓿的抗性育种提供基础材料。 关键词：苜蓿、愈伤组织、低温、DES 人工诱变常用于提高植物抗逆性，在水稻、小麦、甘蔗和红豆草等多种植物中已获得变异细胞系，常表现出较强的耐逆性，并且能选育出抗逆性强的、能稳定遗传的优良品系。本文以化学药剂硫酸二乙酯（DES）和物理因素低温诱变苜蓿体细胞，以期为利用组培法进行抗逆性育种提供原始实验材料和资料。 1．材料与方法 １.１ 材料 选择籽粒饱满、有光泽的准格尔苜蓿（MedicagoSativaL.cv.Neimeng Zhungeer）种子（由黑龙江省畜牧研究所提供）。消毒后用无菌水冲洗，将种子植入无激素MS固体培养基中萌发，经培养7～10d取出茎段（0.5cm）h,光照强度约 1500Lx，温度为25℃。 1．2 方法 1.２.１ 愈伤组织的诱导 将MS培养基中培养7天左右无菌苗，待幼苗长出4个真叶，茎段粗壮时（5mm）L9(34)正交实验的培养基，附加不同激素，22—24℃、散射光下培养。9种培养基分别为： 表1 附加不同浓度激素的培养基 Table 1　The medium of adding different concentration hormones M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 KT 0 0 0 1 1 1 2 2 2 2,4-D 0.5 1 2 0.5 1 2 0.5 1 2 6-BA 0.2 0.5 1 0.5 1 0.2 1 0.2 0.5 1.2.2 半致死温度的测定 选取继代2次的白色松脆的愈伤组织切成直径为4-5mm的小块，接种于盛有继代培养基（MS+6-BA　0.5+2,4-D1）的50ml三角烧瓶中，进行半致死温度的测定。冷冻程序在数字控制的低温离心机中进行。测试温度由室温（25℃）开始，经2h下降至0℃后，以人工控制，每下降１℃停留4h，误差上下小于0.5℃，从0℃到-10℃，温度每下降1℃取出分析样品。将全部经过冷冻的样品置于5℃条件下解冻，24h后置于25℃条件下继续培养，2周后观察半致死温度。 1.2.3 硫酸二乙酯对愈伤组织进行诱变处理 愈伤组织切成约3mm2的小块，分别转入硫酸二乙酯不同浓度的MS液体培养基中，浸泡1、1.5和2h，然后用180目筛网滤出愈伤组织块，将其接种于新鲜的MS固体培养基中，在25℃培养。本实验诱变终止时用大量的的液体培养基冲洗。 1.2.4 脯氨酸含量的测定 在测定样品游离脯氨酸含量时，现多采用Troll的酸性茚酸酮显色法。而对样品的前处理（提纯和纯化脯氨酸）却采用了不同的方法，本实验采用了磺基水杨酸法浸提样品中的游离脯氨酸。 2 结果及分析 2.1 愈伤组织的诱导 表2中的结果显示,准格尔苜蓿愈伤组织的诱导在M2中出愈伤组织时间最短,出愈率最高,说明MS培养基中附加2,4-D为1,6-BA为0.5最适合此种苜蓿愈伤组织的诱导。 表2 苜蓿愈伤组织的诱导 Table 2　The callus induction of alfalfa callus M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 出愈率(d) ()(99999()(9((D) 7 6 11 10 9 11 13 11 17 诱导率(%) 90% 100% 68.2% 87% 84.6% 80% 77% 91.6% 76,4% 2.2 愈伤组织低温半致死温度的测定 愈伤组织小块低温处理后经过两周生长，部分小块褐化死亡。未褐化的小块继续分裂生长，其结果如表3。以50%愈伤组织没有发生冻死的最低温度为半致死温度，则愈伤组织小块低温半致死温度为-5℃。 表3 低温处理后苜蓿愈伤组织存活率 Table 3　　The survival rate of alfalfa callus in low temperature stress 温度（℃） 25 0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10 存活数（块） 14 12 10 8 9 7 5 4 2 0 0 0 总数（