植物疫苗无致病力青枯雷尔氏菌发酵工艺的初步研究.docVIP

植物疫苗无致病力青枯雷尔氏菌发酵工艺的研究 摘要：本研究在30L全自动发酵罐从菌体生长开始，研究了发酵过程发酵液的pH值、溶氧量DO）、粘度值、菌浓度、菌弱化指数、菌体形态等状态参数的变化，分析了各参数对发酵的影响，作为判断发酵过程的综合指标。综合各方面考虑确定该菌发酵的最佳时间为48小时。该研究为无致病力青枯雷尔氏菌发酵放大工艺研究提供了依据。 关键词：无致病力青枯雷尔氏菌；发酵工艺；状态参数 前言 细菌性青枯病是一种由青枯雷尔氏菌引起的毁灭型土传病害，主要分布在热带和温带地区，世界各地许多地区都有广泛报道[1]。青枯雷尔氏菌可危害44科的300多种植物，其中，对茄科植物的危害甚为危害[2]。Schell[](1994)等报道强致病力青枯雷尔菌株能分泌胞外多聚糖I（exopolysaccha-ride I，EPS I）,附着在青枯雷尔氏菌细胞外，是青枯雷尔氏菌的主要致病力因子，影响和阻碍植物体内的水分运输特别是容易对叶柄结和小叶处较小孔径导管穿孔板造成堵塞，因而引起植株枯萎。同时本实验室对不同致病性青枯雷尔氏菌多态性的研究表，强致病力青枯雷尔氏菌细胞周围布满黏性物质，使得细胞边沿界线不清，而无致病力菌株细胞周围没有黏性物质，细胞边沿界线清楚 []。由此推测无致病力青枯雷尔氏菌有用于防治青枯病的潜能。 对于青枯病的防治，多年来国内外一直予以高度重视。目前，采用化学农药防治效果不够理想，抗病育种工作难度较大，农业措施亦有较大的局限性，因此，采用生物防治将是一条有效的途径[]。特别是无致病力青枯雷尔氏菌对作物青枯病的生物防治，从20世纪80年代初开始，在国内外青枯病的生物防治研究和应用方面，已有许多报道我国台湾Chen（1984）用无致病力产细菌素的青枯雷尔氏菌（ABPS）121菌株、日本Tanaka等（1990）用ABPS-M4S菌株及其噬菌体、日本的Hara和Ono（1991）用ABPS-OM2菌株、朝鲜Yi（1991）用ABPS-Y61-1菌株防治烟草青枯病，任欣正等（1993）用ABPS菌株MA-7和nOE-104防治番茄青枯病，均取得温室或小区试验的良好的防效[]。郑继法等（1994）研究了烟草细菌性青枯雷尔氏菌的无毒产细菌素菌株对烟草青枯雷尔氏菌4-11的防治作用，结果显示无致病力菌株对致病菌具有防治效果[]。但大多从致病防治方面进行研究，对该菌的发酵工艺报道甚少 拓展植物疫苗无致病力青枯雷尔氏菌药剂的发展，微生物发酵过程中，各检测参数间存在错综复杂的相关性，并随代谢进程而变化。只要某一水平环节上产生瓶颈问题就会产生全局性影响[]。为了提高发酵菌株生产，降低能量和物料消耗，生产更多的产品，可通过各种检测手段了解各种状态参数随时间的变化，并予于有效的优化控制，对发酵生产的稳定和提高具有重要的意义[]。本试验就对无致病力青枯雷尔氏菌在发酵过程中各参数的动态变化进行跟踪研究，建立各参数与发酵时间的相关模型，以期为后续的发酵优化控制奠定基础。 1、材料与方法 1.1供试菌株和培养基 无致病力青枯雷尔氏菌FJAT-T8（Ralstonia solanacearum FJAT-T8）为福建省农业科学院农业生物资源所微生物保存中心分离保存。2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）培养基培养基：葡萄糖5g、蛋白胨 10g、水解酪蛋白 1g、琼脂17 g、水1 L，混合灭菌后冷却至600C左右，加入TTC，使其终浓度为0.005%（W/V）。SPA液体培养基：蔗糖20.0 g、 蛋白胨5.0 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4 0.25 g、水1L、PH7.0~7.2。 1.2 菌株的发酵及采样 将供试保存菌株在TTC平板上进行划线，300C活化培养24h[-10]，活化菌株。将活化后的菌株接至SPA液体培养基中，200 r/min摇床培养36 h。然后种子液cfu/ml）按1%接菌量SPA培养，发酵罐进行发酵，罐搅拌器转速200 r/min，罐温控制280C~300C。从进罐发酵开始取样，而后每隔8小时定时取样，样品重复3次，用于发酵液各状态参数的测定。 1.3 发酵液各状态参数的测定 （1）DO）和pH值检测：发酵罐内安置检测探头，仪器自动记录发酵各阶段DO及pH值的动态变化。（2）粘度值检测：采用），选择转子V0，转速60，取25ml发酵液进行粘度值检测。（3）菌检测：发酵液样品稀释100倍，利用血球计数板计数，计算样品菌体大概浓度；并根据计数结果将样品稀释至合适浓度后，在TTC平板上涂布培养，计数样品中菌数。（4）弱化指数检测[]：在用稀释涂板法测定菌体数的同时，随机从TTC平板上选取10个菌落，用游标卡尺测量菌落的红斑半径与菌落半径之比，计算处于不同发酵时段菌体的弱化指数。（）菌形态检测：吸取1.0 mL培养菌液于1.5