微量中和实验详解.docxVIP

微量中和 在微量中和实验前，首先要用测病毒的TCID50。在微量中和试验中，病毒最小的工作浓度是100TCID50。第一天稀释成梯度的血清与标准量的病毒结合，第二天用ELISA检测病毒感染的细胞，先使用抗A型流感的NP蛋白的鼠源单克隆抗体检测病毒在MDCK细胞中的复制，从而反应出血清样本对某种病毒的中和作用。每次实验包括阴性、阳性血清对照和病毒滴度回滴处理。如果动物血清样品作为对照，须在使用前用RDE酶处理。同时每个微量板要设四个病毒对照孔(VC)和四个细胞对照孔（CC）。 操作流程图： 注:第一、二步稀释中和实验和第三、四步加入MDCK细胞感染未被中和的病毒须在第一天完成。第四、五步用ELISA方法检测被感染的MDCK细胞在第二天做完。 微量中和步骤： 1.血清在37℃水浴快速溶解后，并迅速放入冰上，或者在56℃水浴锅中放30分钟进行灭活。经过加热灭活的血清可以在4℃过夜保存，血清长期保存需放在在-20℃条件下。 2.处理好的原始血清先进行1:5稀释，我们建议在96孔板血清进行以2为倍比的稀释。吸取50ul加热灭活的血清加入200ul稀释液中。混匀后吸取125ul，加入第一个管中，一直连续稀释到最后一管。使血清稀释比达到1:10，1:20,1:40,1:80,1:160, 1:320, 1:640, 和1:1280。其中每一孔保持均250ul。 3.吸取50ul的稀释血清从试管中到四个微量板（每一个病毒两个板）从第H排一直转移到第A排，并及时更换枪头。配100TCID50病毒的同时,要把板盖上放在37°C, 5% CO2培养箱中。同时要保持合适的PH，不要使病毒因PH变化而受影响。 4.根据TCID测试结果配正确的工作病毒浓度，并在冰上保存。每个板需要5ml的病毒液。添加50的配好的病毒到加入含有血清的孔和病毒对照组VC (A12, B12, C12, 和D12)中。同时细胞对照组CC(E12, F12, G12, 和H12)只加入50ul稀释液。轻拍板进行混匀。 5.每次实验都要做一个工作病毒液的回滴。（一般在第十一列），加50ul稀释液于细胞板的一列。在该列第一个孔中加入50ul的工作病毒液，然后以2倍比连续稀释到第8孔后，弃去50ul。 防止病毒的残留，每次移液都需要换枪头。添加50的稀释液到每一孔中，每一孔都达到100ul。封口在37°C, 5% CO 2条件下孵育1h，在孵育期间要准备MDCK细胞。 6.把 100ul的含1.5 × 10 4 cells的MDCK细胞分装到96孔细胞板的每个孔。在37℃和5% CO2条件下培养18—20个小时。 7.经过培养后，细心地去除96孔细胞板中的培养液，用200的PBS进行洗涤，并谨慎的吸取。并把细胞板反扣在吸水毛巾上进行敲击。 8.加100ul冷固定剂到各孔，且在添加前要保持细胞板湿润。盖上盖子在室温下孵育10-12分钟。 9.小心的吸除固定液，用喷洒了70 ％酒精的纸巾擦干净细胞板外表。让细胞板在BSC中直到干燥10分钟左右。当酒精完全干时，细胞板可以从BSC拿出。 10.镜检细胞板的每一个孔，观察在细胞形成单层时减少的细胞融合的数目，并与对照组CC进行比较观察。在具有低稀释度血清的孔，细胞毒性最容易被观察到。细胞板在进行ELISA前在4℃的条件下最多可以保存2d，且细胞板要放在封口的塑料袋中。 11.用抗体稀释液稀释一抗(mouse anti-influenza A NP) 到预定可观察的工作稀释度，反复吹打混匀。用300ul的清洗液洗三次板后，添加100ul的稀释过的一抗体到每孔中，盖板在室温下孵育1h。 12. 用抗体稀释液稀释二抗(goat anti-mouse IgG HRP labeled)到预定可观察的工作稀释度，反复吹打混匀。用300ul的清洗液洗三次板后，添加100ul的稀释过的二抗体到每孔中，板在室温下孵育1h。 13.准备柠檬酸盐缓冲液，用300ul清洗缓冲液洗5次板。用柠檬酸盐缓冲液配OPD基底液现配现用，在吸水纸上敲击洗过的板后。加入现配的100OPD基底液于各个孔中。在室温下孵育，当 VC孔(column 12, rows A–D)有强烈的颜色变化而CC孔没有相应的变化时截止。在VC孔的OD均值最低为0.8，一般在1.0-1.5之间变化，更高的值也是可以接受的。在CC孔的的OD均值要小于等于0.2。不同的病毒要获得的目标的OD值需要不同的孵育时间。然后用分光光度仪测量在490nm波长下每孔的OD值（吸光度）。如下图所示孵育时间理想的微量中和板。 14.数据分析如下:VC和CC的均值在每个板中起着决定性作用。为了使每个板的各个孔OD值有效，CC组的OD均值小于等于0.2，VC的均值需大于等于0.8。病毒的（BT）回滴是来评估所用的病毒的量是否理