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植 物 的遗 传 转 化 实 验 转基因会不会咬人类一口 转基因食品 一、植物遗传转化的主要方法 DNA直接导入基因转化 化学诱导 物理诱导 种质系统介导基因转化 花粉管通道法 生殖细胞浸泡法 胚囊、子房注射法 生物介导的基因转化 植物病毒介导 农杆菌介导 优点: 操作简单，不需要特殊的仪器，转化效率高、单拷贝、遗传稳定性好等 二、农杆菌的简介 农杆菌属（Agrobacterium） 革兰氏阴性菌，好氧，25-30℃，pH6.0-9.0 根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) Ti（tumor-inducing）质粒 , 能诱导被侵染的植物细胞形成 肿瘤 ,即诱发冠瘿瘤。 发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes) Ri质粒 ,能够诱导被侵染的 植物细胞产生毛发状根。 三、根癌农杆菌致瘤的机制 植物的损伤信号及环境因子 菌体的识别和附着位点的形成 Ti质粒的必需组成元件 根癌农杆菌的染色体基因 1、植物的损伤信号及环境因子 植物损伤信号 糖类和酚类化合物 可指导农杆菌对植物细胞的趋化性移动，并可诱导农杆菌Vir基因的表达。 诱导物 酚类化合物，有乙酰丁香酮、丁香酸、芥子酸、儿茶酚、香草醛等 组成植物细胞壁的特异单糖，如D-半乳糖、D-葡萄糖、D-木糖等 2、菌体识别和附着位点的形成 植物细胞上的受体位点 在植物细胞壁上，由碳水化合物、蛋白质和果胶形成农杆菌附着的受体位点。 农杆菌外膜上的结合位点 蛋白质和脂多糖构成。 农杆菌侵入通道 农杆菌附着到植物细胞上后，分泌出果胶酶等物质，消化植物细胞壁，从而形成农杆菌侵入植物细胞的通道。 Vir区（毒性区） 激活T-DNA转移； 特点：30~40 kb; 包含7、8个操纵子; 编码几十个基因。 3、Ti质粒的组成元件 T-DNA区 从Ti质粒上转移到植物细胞上的一段DNA； 特点：10~30 kb； 两端边界是两个25bp的同向重复序列； 冠瘿碱合成酶和诱发肿瘤的基因。 Con区（接合转移编码区） 编码与细菌接合转移有关的基因(tra); 调控Ti质粒在农杆菌之间的转移; 冠瘿碱代谢区（Opine Catabolism）。 Ori区（复制起始区） 调控Ti质粒的自我复制。 4、根癌农杆菌的染色体基因 Ti质粒的行为受核基因的调控 目前发现7个与侵染相关基因 chvA和chvB基因：与β-1,2-葡聚糖的合成有关，影响附着过程； exoC：与β-1,2-葡聚糖的合成有关； Cel和att：与纤维细丝的合成有关，影响附着过程； chvD：ATP结合蛋白，在主动运输中起主导作用； chvE：葡萄糖和半乳糖结合蛋白，能认别植物受伤后产生的单糖体，导致细菌向植物伤口趋化性。 四、农杆菌介导的基因转化过程 1、农杆菌在植物敏感细胞上吸附 2、农杆菌中Ti质粒上的Vir区基因被激活 3、T-DNA切割和T-DNA复合物形成 4、T-DNA复合物由农杆菌进入植物细胞 5、T-DNA整合到植物染色体上并且表达 Ti质粒 T-DNA TRA OCC VIR CHR virA virG 其他Vir基因的表达 激活 T-DNA复制 损伤细胞产生诱导物 （酚类、糖等） 转录 翻译 冠瘿碱 冠瘿碱分泌 生长素 细胞分裂素 刺激细胞分裂 分解 碳源和氮源 附着 植物细胞 农杆菌 转化与整合 农杆菌介导转化过程 VirE2,D2 五、载体系统的构建 onc-卸甲载体 无毒的Ti质粒载体，Ti质粒由于缺失了T-DNA 一些区域，完全丧失了致瘤作用。 目前基因转化中常用的两种载体系统 双元载体系统 共整合载体系统 双元载体（两个彼此分离的质粒组成） 一个是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T-DNA左右边界序列之间提供目标基因及标记基因等。 另一个为卸甲Ti质粒，主要是提供Vir基因功能，能反式激活的T-DNA的转移。 共整合载体（一元载体系统） 指含有目的基因的中间表达载体与改造后的受体Ti 质粒通过同源重组所产生的一种复合型载体。 六、遗传转化的实验流程 培养基：LB，YEM，YEB等 生长周期：固体培养