应用PCR—RFLP法检测膀胱组织细胞中的H—ras基因是否突变教案.pptVIP

应用PCR—RFLP法检测膀胱组织细胞中的H—ras基因是否突变 09生物科学 519：陈欣 练晓琴 邱河妹 任俊鹏 杨金梅 颜雅玲 膀胱癌在我国泌尿外科肿瘤中，无论其发病率和死亡率均占首位。膀胱癌 至今病因不明，早期诊断疗效较好，手术切除是主要治疗方法，但容易复发。因 此从基因水平研究膀胱癌的发生发展机理，并选择膀胱癌特异性基因进行基因治疗已成为这一领域的研究热点。 研究表明，膀胱癌的发生发展是一个非常复杂的过程，涉及成千上万的基 因改变。正常基因的突变或缺失、癌基因的异常扩增和表达以及多个基因的协同作用、基因本身的多效性和机体免疫因素，决定肿瘤变型的表达与否。目前认为癌基因异常激活和抑癌基因表达抑制是最根本的原因。大量研究证实膀胱癌的发生发展与P53、H-Ras、EGF、P16等基因密切相关. 有关膀胱癌的癌基因和抑癌基因的研究进展非常迅速。这些基因绝大多数与细胞生长、分化、凋亡的调控密切相关。研究发现，膀胱癌的发生与多个基因的改变有关,包括癌基因H-ras、抑癌基因p53、p16等的改变。其中，癌基因H-ras第12号密码子的点远远高于它在其他肿瘤的突变频率。已有相当多的人利用这一特点进行膀胱癌诊断的临床研究，并显示了一定的临床价值。 一、ras—gene 1.1 背景 ras—gene家族是一个普遍存在的真核基因家族，它在进化上是最保守的，在酵母细胞内也有功能完全相同的ras基因，由c—Ha(Harvey)一ras、c Ki(Kirsten)一ras、N(Neuroblastoma)一ras基因组成，位于人类第1I号染色体短臂上 。在人类肿瘤的基因改变中此三者点突变发生的频率最高 。其编码产物都是一种分子量为21000的蛋白质（简称P21蛋白）。 P21蛋白位于细胞膜内侧，可与鸟嘌呤结合蛋白质GTP／GDP结合，具有与鸟苷酸结合的能力和GTP酶的活性，参与膜的信号传导。具体过程目前认为是，由于输入信号的刺激作用，可使P21蛋白释放其结合的GDP，而与GTP结合，即由P21-GDP(灭活状态)向P21-GTP(活化状态)转化，使ras蛋白处于激活状态，从而输送驱动细胞生长的信号到传导链的下游，从而在细胞分化和生长中起到重要作用，而GAP(GTP酶激活蛋白)则可使P21-GTP向P21一GDP转化，这样在正常情况下，P21蛋白只是短暂停留在GTP结合的状态，随即将GTP水解为GDP，其本身又返回为无活性的状态。当ras基因发生点突变，则GAP不能使与突变的P21结合的GTP水解成GDP，使P21蛋白持续处于激活状态，并刺激靶细胞分子，使细胞持续增殖，最后导致细胞的恶性转化 。 1.2 ras基因突变常用检测方法 目前多采用PCR技术，具体有：①PCR一等位基因特异性寡核苷酸法(PCR—ASO)，即PCR扩增DNA，扩增产物在尼龙膜上分别与ras基因第12、13、61位密码子所有可能引起氨基酸改变的碱基突变寡核苷酸探针杂交，探针结合处胶片上呈阳性斑点” 。② PCR一单链构相多态性分析法(PCR—SSCP)，PCR扩增待测DNA，并标记扩增产物，电泳，根据电泳迁移率不同区别开来。③PCR一限制性片段长度多态性法(PCR RFLP)，PCR扩增待测DNA，用限制性内切酶作用于扩增产物，电泳，若突变，该位点不被切割，电泳条带不同 。④PCR直接测序法，将扩增产物DNA测定碱基序列，也可以联合应用以上方法。 二、原理 PCR-RFLP 是在PCR和DNA序列分析基础上产生的RFLP技术。该方法是通过PCR扩增一段DNA片段，然后再选择适当的限制性内切酶，消化PCR产物，经电泳，若突变，该位点不被切割，可得到有特异性的电泳谱带，从而根据电泳后片段大小决定出c-Ha-ras, 在12位密码子是否存在点突变，达到鉴定不同基因型的目的。 三、步骤 技术路线 3.1确定基因序列 3.2引物的扩增 PC1和PC2均为人工合成的20聚体脱氧核糖核酸。PC1的序列为自c-Ha-ras第12位密码突变位点算起正链的上游第31至第50个核苷酸序列；PC2则为负链的突变位点下游第31至第50个核苷酸序列。 人工合成两个20聚体引物PC1和PC2, 使它们分别与点突变位点上游区和下游区不同链上第31至第50个核普酸互补（如下图所示），将总DNA , 二种引物, 四种三磷酸脱氧核酸, 耐热DNA多聚酶混合, 进行30个循环的变性一退火一DNA链延伸反应,, 即多聚酶DNA 链延伸反应使PC1和PC2之间的DNA扩增几十万至几百万倍。 引物扩增 由于第12密码子的任何突变都可使与之重迭的限制性内切酶HpaⅡ识别位点破坏, 如果将PCR扩增后的DNA用HpaⅡ 进行完全酶解然后再进