基因芯片技术要点详解.pptVIP

基因芯片技术 周秀娟 一、基因芯片的基本概念及发展经过 基因芯片(Gene chip) 又称DNA芯片（DNA Chip）或生物芯片(Biological chip),它是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而对靶分子的序列和数量进行分析。 通俗地说，就是通过微加工技术 ，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段（基因探针），有规律地排列固定于2cm2 的硅片、玻片 等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，与计算机的电子芯片十分相似，所以被称为基因芯片。 基因芯片的制作技术主要包括芯片制备，样品制备，杂交反应，信号检测和结果分析。 将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针，然后再与芯片上寡核苷酸点杂交，最后通过扫描仪定量好分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。 该技术可检测各种介质中的微生物，研究复杂微生物群体的基因表达。 二、基因芯片的基本原理 图1、利用基因芯片进行杂交测序的原理 三、基因芯片的技术流程 三、基因芯片的技术流程 四、基因芯片技术与传统杂交检测方式的比较 五、基因芯片的基本构造 1.支持物：如玻片、硅片、NC膜、Nylon膜 2.探针：高密度的探针序列按照一定的次序固定在支持物上，每个位点的序列是已知的 外观 探针 支持物 剖面图 平面局部放大 六、基因芯片的主要类型 从点阵的制备方法分 原位合成型 “点膜”型 原位合成型：根据预先设计的点阵序列在每个位点通过有机合成的方式直接聚合得到所要求的探针分子 优点：合成效率高、点阵密度高 缺点：设备昂贵、技术复杂、反映产率低 “点膜”型：合成工作用传统的DNA固相合成仪式完成，只是合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于硝酸纤维膜、尼龙膜或玻璃片上。 优点：设备廉价、技术简便、研制周期短、灵活度高 缺点：点阵密度低 ｛ ｛ 七、基因芯片技术的应用 （一）、朱晓光、杨银辉、康晓平等人写了13种虫媒病毒基因芯片检测方法的建立等论文 1、方法 （1）寡核昔酸探针的设计与合成寡核昔酸探针 由华大基因公司设计并合成。每条探针长度为70mer,mT介于75一85℃。每种病毒设计5条寡核昔酸探针及相同数量的互补序列探针,用于病毒特异性鉴定。另外,针对以上13种病毒所在的3个病毒属,各设计10条寡核昔酸探针,探针总数为160条,用于属水平的筛查。 （2）、病毒的培养和病毒核酸的提取 EEEV、WEEV、VEEV、MAYV、WNV和JBEV用BHK细胞培养,1-4型DENV用C6/36细胞培养,BUNV用Vero-E6细胞培养。产生细胞病变后,将培养瓶在-70℃冰箱中冻融,用于病毒核酸的提取。 由于以上13种虫媒病毒均为RNA病毒,因此,病毒总RNA用QIAGENRNAeasy试剂盒提取。 （3）、待检病毒核酸的扩增与标记 提取病毒RNA后,用锚定随机引物进行反转录获得cDNA作模板,反转录随机引物序列为5′-GTTTCCCAGTCACGATC-NNNNNNNNN-3′,然后用测序酶合成第二链cDNA,随机PCR扩增用随机引物5′-GTTTCCCAGT-CAOGATC-3′进行,并在扩增的过程中掺入aa-dUTP对PCR产物进行标记,PCR反应体系为100ug,扩增条件为95℃变性5min,然后94℃30s、55℃30s、72℃60s,共35个循环。 扩增产物用Amicon Microcon-PCR纯化柱进行纯化,与lmol/L碳酸氢钠混合,然后将待检病毒及细胞基因组的PCR产物分别与cyTM3和CyTM5偶联,经纯化后可用于芯片杂交。 （4）、基因芯片的制备 使用醛基化处理的玻片,纯化干燥后的寡核昔酸探针用3X标准柠檬酸盐溶液溶解,使终浓度为40umol/L。用Spot Array72进行点样,每条探针重复点样3次,每种样品点成4×4的矩阵,每种病毒的10个探针分散点样在4个矩阵中。点样后的芯片用HoeferLJVC500紫外交联仪以600×100uJ/cm2交联2次,用于芯片的杂交。 （5）、芯片杂交反应 将芯片在含甲酞胺的杂交液中于42℃预杂交1h,同时将标记好并纯化的待检病毒靶核酸溶于含酵母tRNA、Poly-A、SSC及SDS的杂交液中,于99℃变性2-5min后加入甲酞胺,滴加到芯片上,盖上盖玻片后进行杂交,42℃水浴孵育8-16h。杂交结束后分别在2xSSC、0.2xSSC蒸馏水和无水乙醇中进行洗涤。 （6）、结果判