基因的体外转录和翻译资料.pptVIP

* * 体外翻译的实验方法主要用于： 1、基因产物的快速确定； 2、基因突变体的快速和分析； 3、蛋白质活性研究； 4、众多基因产物的同时表达； 5、大分子间的相互作用； 6、影响翻译过程的物质检出； 7、表达对细胞有毒性的蛋白和易于被细胞内蛋白酶降解的蛋白和形成不溶包含物的蛋白。 * * 基因体外翻译的基本原理 基因体外翻译的基本原理是以基因转录产物RNA为模板，在核糖体上进一步生产蛋白质的过程。 基因体外翻译的模板： 1、直接来自体外基因转录实验； 2、细胞内提取的mRNA； 3、通过PCR或RT-PCR产物转录后的RNA。 * * 利用不同模板和翻译体系进行翻译时，应匹配相应的翻译起始序列。如用原核细胞翻译体系时RNA模板应含有SD序列，应用真核翻译体系时，应有帽子结构；在RNA的3ˊ未端含有合适的终止信号。 * * 基因体外翻译的基本实验流程 体外翻译系统的制备：该系统为基因体外翻译提供必要的条件。 1、核糖体：是蛋白质合成的装配机； 2、环境条件：如离子、翻译过程中所需的各种因子等。 * * 常用的翻译系统的制备： 1、细胞裂解物的制备 (1)收集一定数量生长良好的细胞，于10ml培养液中，1500rpm离心5min。得细胞沉淀，用0.01mol/L PBS漂洗2次； * * (2)用10倍细胞体积的预冷缓冲液裂解细胞 (1%Triton X100，150mmol/LNaCl，10mmol/LTris.HCl pH7.4，1mmol/LEDTA，1mmol/L EGTA，pH8.0 0.2mmol/LPMSF，0.5％NP-40)（EGTA：乙二醇二乙醚四乙酸；PMSF：苯甲基磺酰氟；NP-40：壬基酚聚氧乙烯－40醚）； * * (3)裂解液4℃下搅动5min，16000g离心15min后，上清液即为细胞裂解物。 细胞的主要来源：酵母细胞、麦芽组织细胞、兔网织红细胞和Hela细胞。 * * 2、细胞核糖体的分离： (1)收集一定数量的成纤维细胞，迅速放于冰上，4℃ 600g离心10min，收集细胞沉淀，用预冷的TBS悬浮细胞并洗涤3次。 (2)用2倍体积的TBS-M(10mool/LTris.Cl,pH7.5,10mmol/L KCl和1.5mmol/L乙酸镁)悬浮最后的细胞沉淀，0 ℃放置5min，在匀浆器中匀浆10~20次。 * * (3)每0.9ml匀浆液加0.1ml浓缩的10*TBS-M缓冲液，混合，4 ℃ 10000g离心10min。 (4)收集上清提取物，在提取物中加入ATP，GTP磷酸肌酸，肌酸激酶及各种氨基酸。 (5) 37℃培养45min。 (6) 室温下10000g离心混合物10min，冷却上清，在4℃ 条件下进行SephadexG-25柱层析。收集260nm吸收峰，4 ℃ 165000g离心90min 。 * * (7) 加入饱和的(NH4)2SO4的终浓度为60%，经离心收集沉淀。在含有0.25mol/L蔗糖的TBS缓冲液，悬浮有核糖体的液体放在上层， 4 ℃216000g离心2.5h。用TBS-M缓冲液洗涤沉淀，悬浮在具有0.25mol/L蔗糖的同一缓冲液中。 (8) 用UV光谱仪测A260，确定核糖体浓度。 * * 基因的体外翻译反应 基因体外翻译一般在25~35℃温度条件下进行，反应体积在40~100ul之间，反应体系中主要有： 5或10倍的翻译缓冲液10~30ul转录产物，20~50ul细胞裂解物或1~3个A260的核糖体分离物，40~100uCi甲硫氨酸，0.2mmol/L蛋白酶抑制剂 * * 用mRNA模板和进行体外翻译 用分离纯化的mRNA为模板，在分离纯化的核糖体上进行蛋白质合成。 优点：可以进行蛋白质合成中的各种影响因子的分析和蛋白质合成速度的比较分析 缺点：分离核糖体的过程比较复杂，反应条件相对严格 * * 体外蛋白质快速合成体系 此方法把体外基因转录和体外蛋白质翻译放在一个体系中进行，即基因转录后直接进行蛋白质翻译的过程。 优点：可以快速检测目的基因在体外的表达情况 缺点：不能对基因转录和蛋白质翻译过程的细节进行分析 * * 基因翻译产物的分析 凝胶电泳分析 翻译过程完成后，用适当的方法终止反应，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影或液闪的方法进行分析。 放射性核素掺入的百分比分析 * * 基因体外翻译实验中常遇到的问题 翻译产物的低产率可能原因有 1、RNase的污染 2、过量的盐 3、mRNA的二级结构 4、标记甲硫氨酸的质量不高 5、mRNA帽子结构 * * 有非特异性的电泳带 1、不只一种翻译产物，如在真正的起始密码子外还存在其它的起始位点 2、翻译产物的降解 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读