免疫及免疫传感器要点分析.ppt

放射免疫分析：放射活性物半衰期短、损害健康、污物难处理等 光学免疫分析：对于有色样品及不纯样品检测的灵敏性有一定限制 电化学免疫分析及免疫传感器：快速、简便、经济等特点，微型化，均相检测 根据氨基酸排列顺序的不同分为： 可变区(Variable Region ）和恒定区（Constant Region） 可变区（V区）：氨基酸组成、排列顺序变化较大 恒定区（C区）：氨基酸数量、种类、排列顺序及含糖量都比较稳定 免疫分析 基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段； 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。 免疫的原理 Ag + Ab Ag－Ab 特异性、灵敏性 在Ag，Ab反应中，用容易示踪的化学物质标记一种反应物，以了解反应是否发生，发生部位，以及发生的程度（即对未知成分的样品进行定性、定位及定量分析）。 免疫学检测历史演进 放射免疫检测（兴起于20世纪70年代，现仍普遍使用于县级以上医院）； 酶联免疫检测（兴起于20世纪80年代，各临床机构普遍使用）； 以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术（20世纪90年代开始推广使用，产品步入成长期）三个阶段。 4.3.1 酶联免疫法 免疫酶技术：把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来。它具有免疫荧光试验和放射免疫试验的优点，并克服上述两种方法的缺点。 酶标记试剂制备容易、稳定、有效期长，免疫酶技术的敏感性接近放射免疫试验，可直接肉眼观察也可借助简单的仪器作定量测定，所得结果比较客观。 酶免疫测定或免疫酶技术是指酶标记抗体或酶标记抗体进行的抗原抗体反应。它主要包括两个方面： 免疫过氧化物酶法：以过氧化物酶作为标记，与抗原或抗体结合，然后根据酶与其底物间所产生的不溶性颜色产物，借助于光学或电子显微镜观察细胞及亚细胞水平的抗原或抗体。 酶联免疫吸附法（ELISA)：根据可溶性抗原或抗体与不溶性固相载体结合后，还保留其免疫活性，结合了作为标记的酶催化作用。 步骤： A 将已知抗体吸附于载体上，温育后清洗； B 加入待检标本溶液，使溶液中的抗原与吸附的抗体结合，温育后清洗； C 加入酶标记特异性抗体，温育后清洗； D 加入酶作用底物，产生显色反应，颜色的改变与所加的待检标本溶液中的抗原量成正比。 步骤： A 将已知可溶性抗原吸附于载体（聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠），经温育后清洗； B 加入待检稀释血清，若血清中有相应特异性抗体存在则与吸附的抗原结合，温育后清洗； C 加入酶标记的抗球蛋白抗体，此时酶标记抗抗体与吸附的抗原抗体复合物结合，温育后清洗； D 加入酶作用底物（或称基质），酶分解底物并显色，用光电比色计测定底物显色深浅，即可推知抗体量。 步骤： A 将已知抗体吸附于固相载体表面，温育后清洗； B 将可能含抗原的待检溶液和酶标记的已知抗原溶液以适当比例混合，加入已包被的载体孔中，温育后清洗； C 加入酶作用的底物，产生显色反应。色深表示结合的酶标记抗原多，而待检溶液中未标记的抗原量少；反之，色浅表示结合的酶标记抗原少，而待检溶液中抗原量多。 捕获法 4.3.2竞争性免疫分析体系 基于竞争免疫分析的免疫传感器用来检测小分子物质雌二醇 E. Zacco, R. Galve, M.P. Marco, S. Alegret, M.I. Pividori, Biosens.Bioelectron. 22 (2007) 1707. Fig. 6. Schematic representation of the electrochemical competitive immunosensing strategy for the detection of atrazine in orange juice with ProtA-GEB-based biosensors, showing the immobilization (A and B) and the competitive immunological reaction (C). 竞争性电化学免疫分析和免疫传感器还广泛应用于重要的临床分析物的检测。 尽管竞争免疫分析比较简单，但其缺点在于待测物标记后与抗体的结合能力可能减低甚至消失，特别是当标记物靠近抗原决定簇时，此现象尤为突出。 非竞争性免疫分析体系（即双抗体夹心免疫分析）通过过量的抗体与抗原反应，使抗原与样品溶液分离，形成的免疫复合物再与过量的信号二抗反应，其中二抗只特异性地与固定的抗体-抗原复合物结合。 通常需要加入封闭剂减少非特异性反应 当检测体系