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Western Blotting样本的制备: 贴壁细胞蛋白裂解相关试剂的配制： 1. 20ml 1×SDS Lysis buffer的配方： 2.PBS的配制:将购买的一袋PBS粉末溶于2L DDW中即可 标注：1）配PBS的容器以及配好后所盛PBS的瓶子，先用自来水冲洗干净，再用蒸馏水过三遍，最后用DDW过一遍。将水控干，即可配制PBS及盛配好的PBS。 2）搅拌用的转子用自来水冲干净后，最后也用DDW冲一下，再放到溶液中搅拌。 3）4℃保存 3.试剂来源：Tris-Hcl （100g Solarbio T8230 天津科瑞杰生物 ） SDS （100g USB 75819 北京中原领先科技有限公司 ） 甘油 （500ml Solarbio G8190 天津科瑞杰生物 ） PBS (2000ml/袋 天津伯比特生物技术有限公司 ) BCA法测蛋白浓度 做标准曲线得出计算浓度公式，现为y=0.0012x＋0.0854。（y表示OD值，x表示所得浓度ug/ml） 待测样本的制备：一般稀释5倍（即11ul原液+44ulDDW）；如浓度太高超过标准曲线所绘OD值，应将其稀释，一般稀释10倍（即11ul原液+44ulDDW） 配制工作夜：A：B=50:1 （BCATM Protein Assay ReagentA:500ml Thermo 23228 天津博亚伊诺维信生物技术有限公司） （BCATM Protein Assay ReagentB:25ml PIERCE 1859078） 具体根据所测样本的个数决定A、B液各取多少，每个样本需加两个副孔，一次实验需设两个对照孔。因为 加样过程会有损耗，故一般多配出100ul即可。 在96孔盘中，根据计算好的孔数，每孔先加入200ul工作液，两个孔一组各加入25ul稀释好的待测样本,对照组各加入25ulDDW。记好样本所加位置，以免错位。 充分混匀，在微量震荡器震30s。 37℃孵育30min。 冷却到室温，用酶标仪检测波长为562时各孔的OD值 。 根据标准曲线得出的计算浓度公式来计算每个样本的浓度。 用小标签纸标好样本名称、浓度、日期（写测BCA当天的日期）。对应贴好，将样本放－20℃保存。 标注：1）37℃电热恒温培养箱需提前开。酶标仪在30min孵育时间开即可。 2)每个孔在加样本时注意不要有气泡，因为气泡会影响吸光度，得出的OD值也会不准确。 3）计算时先求出每个样本OD值的平均值，再代入公式。此时得出的x为稀释后样本的浓度，故还需乘以稀释倍数才是样本最终的浓度。 4）待测样本制备好以后需先将原液放4°。 Western Blotting凝胶电泳试剂的配制 1. Solution1:（神经毒性，戴手套） 丙烯酰胺（acrglamide） 58.4g 加DDW溶解后定容至200ml 避光4°保存 BIS (亚甲基双丙烯酰胺) 1.6g 标注：1）在配置过程中都要避光，容器用锡纸包起来。 2）因为购买的丙烯酰胺纯度不是100%，会有一些杂质，所以完全溶解并定容后，还需过滤到棕色瓶内。 3）此试剂在液态时有毒，故手套接触其后不要到处乱摸。 2. Solution2: Tris 36.3g 溶于150ml DDW SDS 0.8g 调PH至8.8，加DDW定容至200ml，室温保存。 3.Solution3: Tris 6.06g