72综述.docVIP

7-2 食源性致病菌的快速检测 食源性快速检测的技术： 1.免疫学检测技术 2.核酸探针技术 3.聚合酶链反应 PCR 等技术 4.生物芯片技术 5.生物传感器检测技术 6.其它技术 微生物快速检测方法特点 1快速,一般在几小时至24小时内； 2灵敏度高、特异性高； 3操作和使用比较简单 一、免疫学检测技术 免疫检测的基本原理是抗原抗体反应。抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。不同的微生物有其特异的抗原并能激发机体产生相应的特异性抗体。在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测微生物的特异抗原，也可利用微生物抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。由于细菌表面结构复杂，其抗原较多，同属细菌中有致病菌也有非致病菌，如A族链球菌为致病菌，而粪链球菌一般不致病，此外，不同细菌之间，细菌与宿主之间也可能存在共同抗原，故实际所开展的研究方面很少仅根据抗原检测判断致病细菌。检测细菌的抗体，要结合病原菌的污染程度来作出初步诊断，若被测病原菌的抗体浓度逐渐升高，就可以明确地给出判断结果。病毒、立克次体、支原体、衣原体抗原结构简单、特异性较好，加之难以培养、分离，应用免疫学试验诊断具有很大的实用价值。一般情况下，在实际被检测物品中检测到上述微生物抗原可判断为该物品受到污染，而只发现抗体，只能表明该机体感染过该微生物。 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂： （1）固相的抗菌素原或抗体，即免疫吸附剂（immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为结合物 （3）酶反应的底物。 常用的ELISA方法的检测时间包括加样、保温、洗 涤、加抗体等时间。操作时间长， 步骤烦琐。2002年美国生产的自动酶联荧光免疫检测系统 VIDAS t51。该系统根据ELISA 的基本原理，采用“夹心技术”，检测蓝光与抗原成正比，可以在45min至2h内完成全部检测工作。 核算分子检测技术 1.PCR：polymerase chain reaction 2.Southern杂交 3.Northern杂交 4.LCR：ligase chain reaction 5.PCR-ELISA检测 PCR：　多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外DNA扩增技术，此法操作简单，可在短时间内使目的DNA扩增100万倍。待检DNA经94℃高温变性成单链作模板，加入一对引物分别与待扩增DNA片段的两端互补。在低温55℃条件下，引物与模板互补结合。在72℃，由DNA多聚酶将4种dNTP掺入新合成的链中，经过35个循环，可合成大量特异的目的DNA。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后即可观察到特异的扩增条带。 PCR方法灵敏度高，可检测出少至0.lpg的目的DNA。该技术发展很快，已从一般的PCR发展到巢氏扩增、逆转录PCR、单链构象多态性（SSCP）。 其发展趋势： 一是定量PCR； 二是PCR全自动化（如扩增与检测于一体的一次性PCR，可较好地解决PCR污染问题）。因此，PCR目前已广泛应用于多种病原微生物及寄生虫的检测。 PCR-聚合酶链式反应体系 模板DNA 或RNA 一对寡核苷酸引物 4种脱氧核糖核苷酸 dNTPs 热稳定的聚合酶 Taq ； Mg+缓冲液。 荧光PCR Real Time PCR PCR + 荧光标记 + 监测系统 Non-specific DNA binding dyes SYBR? Green I Ethidium Bromide Specific Hybridization Probes TaqManTM molecular beacons dual-oligo FRET pairs “实时”PCR，表示PCR扩增产物可被实时检测。准确地说，“实时”是指在每一个PCR循环后检测扩增产物，当PCR扩增反应结束后，我们可以得到每个样品的PCR扩增产物变化曲线。通过分析这些反应曲线，不但可以得到病原体的定性检测结果，还可以对病原体的数量进行精确定量。 实时荧光PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于应用了荧光探针，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。如一般PCR产物都需通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会。而实时荧光-PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端从而可以快速以及