转基因植物的筛选与检测详解.pptVIP

转基因植物的筛选与检测 转基因植物的筛选与检测 问题 1.进行转基因操作了，如何选出来已成功 导入基因的细胞？ 2. 转化体里的外源基因是否成功的表达了呢？ 1 一、筛选的方法与原理 通过特定基因在转化体内的表达，利用特定的试剂，选择出来转化细胞。 注： 1.特定基因又称“抗性基因” 2.表达方式：蛋白质的合成、酶的失活等 表“植物遗传转化中的选择试剂及其抗性基因” 2 3 二、检测的方法与原理 利用特定基因在转化体内的表达，对其表达产物进行检测。 不同分子水平上检测方法： Southern PCR Northern qRT-PCR Western 4 报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。 必须具有以下几个条件： (1)已被克隆和全序列已测定； (2)表达产物在受体细胞中原本不存在； (3)其表达产物能进行定量测定。 例如：Kan 抗性基因、Gus 基因、Bar 基因 5 Gus基因存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。 缺点： （1）染色不均匀 （2）不能进行亚细胞定位 （3）不能进行活体染色 6 Southern 印迹杂交是利用标记的探针（probe）与膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。 特点： 可清除操作过程中的污染 (如 DNA 分离及植物 DNA 分离过程中的交叉污染) ，以及转化愈伤胞间质粒残留所引起的假阳性信号，准确度高。 Southern 杂交程序复杂，成本高 ，且对实验技术条件要求较高。 7 Northern 杂交的主要原理是把变性 RNA 转移和固定在特定的薄膜上 , 用特定的 DNA 探针来检测 RNA。 特点： Northern 杂交与Southern 杂交相比 , 更接近于性 状表现 , 更有现实意义 , 被广泛用于转基因植株 的检测。但RNA 提取条件严格 , 在材料内含量少 , 不适于大批量样品的检测。 8 Western 印迹是将蛋白质从 SDS胶中电泳转移至固相支持体上 , 然后对固定化蛋白质进行免疫学测定的方法。 特点： Western 杂交灵敏度极高，可以测出粗蛋白提取 物中小于 50ng 抗原，在较纯的制剂中 ，可测出 1～5ng 抗原。能直接显示目的基因在转化体中 是否经过转录、翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现。 9 PCR/qRT-PCR 是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段的有效方法。 特点： 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳 ，染色后很容易观察，不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些顺序。材料用量少，检测方便，可以在试管苗阶段，甚至对愈伤组织进行检测，了解转化早期的信息，便于及时优化试验方案。DNA提取方便，适合于大批量样品分析，又能检测目的基因的完整性，是早期检测的一种较好方法。 10 Southern杂交 1.提取DNA 2.电泳 3.变性 4.转膜 5.固定DNA 6.探针的标记 7.杂交与检测（NBT/BCIP显色） 印迹 DNA 膜 转移 11 Southern杂交 转膜仪 把膜和胶片紧密结合，压！ 12 转膜 注意： 此过程最重要的是保持各DNA片段的相对位置不变。故而称为印迹（blotting）。 用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙膜（Nylon） 、化学活化膜和滤纸等。 双链DNA 变性 单链DNA 转移 固相支持物 电泳槽、缓冲液、夹板 13 Western 1.制胶及上样 2.电泳 3.转膜 4.封闭 5.抗体孵育 6.曝光显影 曝光显影后的条带 14 总结：这些技术需要转膜、杂交，操作繁琐，费用高,可对转基因植株随机取样检测。 Southern 杂交特异性强，确定转基因植株中基因的存在、整合及稳定性，是检测外源基因的最可靠的方法。 Western杂交灵敏度高，能检测出蛋白质表达量，最具有现实意义。 15 谢谢大家！ * *