22聚丙烯酰胺凝胶电泳要点.pptVIP

聚丙烯酰胺凝胶电泳 （1）丙烯酰胺结构式 PAGE 的 聚 合 需要催化剂——氧化还原系统作用，使Acr单体带有游离基，从而与Bis进行聚合。 （1）化学聚合：AP-TEMED系统 过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammonium persulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。 AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。 TEMED的游离碱基能促进AP的形成SO42- 。 注意： ?TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合 ?分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧 ?升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合 （2）光聚合：核黄素-TEMED系统 核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。 注意： 分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 概述 1967年由Shapiro建立。 1969年由Weber和Osborn进一步完善。 他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视。 (2)强还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT） 使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。 PAGE的浓度与孔径的关系 PAGE孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的单体浓度。 Acr/Bis：20~40 完全透明且有弹性； ＜10 很脆，易碎，不透明； ＞100 糊状不成形，易破碎。 凝胶总浓度T ——100ml凝胶溶液中含有Acr和Bis的总克数。 T=（a+b）/m×100% T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。 T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。 C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。 C=b/（a+b）×100% 当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。 3、分类 实验步骤 一、制胶 1.配胶 配胶应根据所测蛋 白质相对分子质量范 围选择适宜的分离胶 浓度。由于SDS有连续体系和不连续 体系两种，两者各有 不同缓冲体系，因而 有不同的配制方法。（以不连续体系为例） 2.分离胶的制备 胶灌至距梳子齿下端1cm→灌毕→封上一层水加速 聚合→当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。 3.浓缩胶的制备 用滤纸吸干水→倒入 浓缩胶→插入梳子→静置，聚合。 二、样品处理与加样 1.样品处理 2.加样 小心拔出梳子 上下槽 注入电极缓冲液 用 微量进样器点样 三、电泳 接上电泳仪，上槽为负极，下槽为正极。打开 开关，保持恒压进行电泳。 流程图 1.相对迁移率的计算 2.标准曲线的绘制 以每条Marker带的相对迁移率为横坐标，相应分 子量的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。如图 3.未知蛋白质样品分子量的测算 计算未知蛋白质样品的相对迁移率，在标准曲线上找到对应的纵坐标，即可得该样品的分子量。如图 注意事项 1.SDS的纯度：市售SDS(A.R.)需重结晶后再用。 2.SDS与蛋白质的结合量：大多数1.4g SDS/g蛋白质 影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个： (1)溶液中SDS单体的浓度 (2)样品缓冲液的离子强度 (3)二硫键是否完全被还原 3.凝胶浓度：应根据位置样品估计相对分子质量， 选择适当的凝胶浓度。测定蛋白质相对分子量时， 必须同时作标准曲线，不能利用这次的标准曲线 作为下次用。 4.多亚基蛋白的分子量：有许多蛋白质，是由亚 基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α-胰凝乳蛋 白酶）组成的， SDS测定的只是它们的亚基或 单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。 5.特殊蛋白质的相对分子质量：不是所有的蛋白 质都能用SDS测定其分子量。包括：电荷异常或 构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些 糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。 6.