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液相色谱的方法开发 （一）分离方法 第一步干什么? 想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法 查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA--- 仪器制造商的文献，如Dionex,Waters 充分了解您自己的样品 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法 分析时要了解哪方面的情况？ 灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用? 分离(制备)时要了解哪方面的情况？ 要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成? 什么化合物参数能用于分离 ? 一般的具体步骤 先用一根短的色谱柱 用相对较高的流速 使用尽可能纯度高的标准品 先用高强度的洗脱液 调节k’ 值改变保留值 调节a值改变选择性 调节柱长度改变柱效及分离速度 使用文献方法注意点 色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 注意文献方法的流动相 是否损害色谱柱? 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 注意色谱柱的规格：内径、柱长 需要调整流速、进样量 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度） 色谱方法转换 如果没有与文献或要求相近的色谱柱 转换进样量 转换流速 反相色谱的方法开发 开发过程实例 色谱条件∶ 色谱柱：C18，4.6mm×15mm 流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 （或走梯度） 流速：1ml/min 样品： ① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) ② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) ③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben) 改变容量因子 K‘ 改变选择性∶a 通过改变流动相组成改变选择性 同样强度的不同溶剂 改变色谱柱 固定相优化 分离度与 k’, N, 和 ? 的关系 选择初始色谱柱 准备第一次运行 最初的分离步骤 最初的结果 等梯度还是梯度分离? 等梯度 优化流动相 - 困难的分离 三种流动相的比较 离子型化合物的分离方式 使用离子交换柱∶离子交换法 主要用于“强”阴、阳离子 使用反相柱 离子抑制色谱法 通过改变流动相的pH值，使样品成中性 离子对色谱法 加入“对离子”，使样品呈中性 离子抑制色谱 离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离 适用于弱酸性化合物的分离 降低流动相的pH值，使样品降低离子化 使用硅胶基质C18填料 使用条件应在填料基质的范围内 硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内 离子抑制色谱的使用范围 如果： 一些酸在pH低于2时还保持离子化 一些碱在pH高于7时还保持离子化 可以有以下的选择 离子交换色谱 使用聚合物反相柱，在pH高于7时用离子抑制法 使用“离子对色谱法” 分离弱离子化化合物的初始实验条件 缓冲液 离子抑制色谱实例 在乙腈/水及pH=7时，多数保留时间很短，无法完全分离。 离子对色谱法 在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂 与样品中可电离的组份形成“对离子” 在反相色谱柱上分离离子型化合物 离子对试剂的类型 季铵盐、叔胺盐 （正离子），适用于弱酸 烷基磺酸盐、高氯酸盐（负离子），适用于弱碱 烷基长度不同，形成对离子的能力不同 离子对反相 HPLC 分离强酸和强碱 离子对反相HPLC分离阴离子 离子对色谱的应用 离子对色谱分析水溶性维生素 优化离子对 HPLC 方法开发的其他因素 流速对柱效的影响 不同内径的色谱柱有自己的最佳流速 样品的进样量(浓度)对柱效的影响 样品的进样体积对柱效的影响 溶剂粘度对柱效的影响 以上因素均影响分离度 液相色谱的方法开发 （二）梯度方法 梯度洗脱的特点 优点 单位时间的分离能力增加 检测灵敏度提高 缺点 仪器设备要求高 不适合某些检测方式(RI) ，UV小于230nm波长 柱需再生平衡 定量分析的重复性较低 梯度的洗脱方式 高压梯度及低压梯度 一般流出问题 梯度洗脱 - 一个解决方案 梯度方法开发- 优化溶剂梯度 计算尝试运行的梯度时间 选择梯度陡度 改变流速 HPLC测定17种氨基酸举例- AQC衍生 一.仪器： DIONEX公司-Summit HPLC系统 P680系列四元泵（包括四元在线脱气装置） 紫外/可见检测器; 柱温箱; 手动或自动进样器 氨基酸分析柱; CHROMELEON色谱工作站 二.化学试剂及配制 3).流动相A：称取NaAc·3H2O 19.04g(或无水NaAc 11.48g)溶解于1000ml纯水中， 用1 ：1的稀磷酸溶液调节PH到约