猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌复合PCR检测方法以及其猪胸膜肺炎放线杆菌PCRELISA检测方法的建立.pdfVIP

PCR—ELISA检测方法的建立! 朱吕昌：App、Pm、Hps复合PCR检测方法以及App 猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌 复合PCR检测方法以及猪胸膜肺炎放线杆菌 PCR．ELISA检测方法的建立 研究生：朱吕昌 导师：陈义平副教授 摘要 胸膜肺炎放线杆菌似ctinobacillus parasuis，Hps)是一种条件致病菌，可以引起猪的纤维素性肺炎，关节炎和脑膜炎。 胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌都是猪呼吸道常见的重要致 病菌，都可能导致或者继发于其他病原感染，给养猪业造成严重的经济损失。这 三种细菌引起的临床症状很难区分，多重感染也给传统的细菌学诊断方法带来困 难。因此，本研究建立了一种能够快速诊断鉴别这三种细菌的复合PCR检测方法。 PCR检测方法在检测临床样本时，尤其是当多种其他物种的DNA存在时，可能 会出现非特异性扩增。当非特异性扩增产物的大小和预计阳性产物大小相似时， 就可能发生误判，出现假阳性结果。为了对PCR产物进行定性，提高检测方法的特 异性和敏感性，本研究还建立了针对胸膜肺炎放线杆菌的PCR．ELISA检测方法。 一、猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌复合PCR检测方法的 建立 本研究根据胸膜肺炎放线杆菌apxVIA基因序列设计用来检测胸膜肺炎放线杆 16S rRNA基冈的种特异性序列设计多杀性巴氏杆菌的特异性下游引物 Co．16S—lower根据细菌16SrRNA基因前端和末端的保守区域序列设计，可以和研 PCR—ELISA检测方法的建立旦 朱吕吕：App、Pm、Hps复合PCR检测方法以及App 究中涉及的所有细菌的模板反应，扩增出大小约为1370．1400bp的产物(不同细菌 杆菌的共同上游引物。猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌模 胸膜肺炎放线杆菌标准株，6株多杀性巴氏杆菌标准株，1～15型副猪嗜血杆菌以 及25株经生化鉴定确认为上述三种细菌的分离株的基因组DNA作为模板进行检 测，均获得预期大小的扩增产物。以猪放线杆菌、吲哚放线杆菌等15种常见细菌 作为阴性对照进行PCR检测，结果均为阴性。复合PCR针对胸膜肺炎放线杆菌、 的复合PCR检测方法有比较好的特异性和敏感性，可以用于猪胸膜肺炎放线杆菌、 多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的快速检测。 二、 猪胸膜肺炎放线杆菌PCR．ELISA检测方法的建立 本研究的目的是建立具有更高特异性和敏感性的猪胸膜肺炎放线杆菌的诊断 方法。所有血清型的猪胸膜肺炎放线杆菌都具有apxVIA基因，并且该基因3’端，5’ 端和中部的部分区域序列十分保守。本研究通过序列比对，选择保守区域设计引 物ApxIV-upper和ApxIV—lower，其中Apx 产物进行定性，本研究根据扩增区域内部的序列设计了种特异性探针P1和P2。P1 和P2的序列相同，只是P1的5’端标记了地高辛。种特异性的探针以液相杂交的方 式检测PCR产物。探针在较高的退火温度条件下仅仅与完全匹配的DNA链杂交， 避免了普通PCR可能出现的假阳性结果，提高了检测方法的特异性。PCR．ELISA 的敏感性比相同引物的单纯PCR高出约100倍。未经标记的探针P2的作用是对 菌的DNA并发生特异性扩增，Pl就会特异性得与扩增产物杂交，P2的存在会干扰 这种杂交，使OD值显著降低。但如果阴性对照也出现类似的OD值的显著降低，则 说明出现了非特异性的杂交。 PCR—ELISA检测方法的建立坐 朱吕昌：App、Pm、Hps复合PCR检测方法以及App 关键词：猪胸膜肺炎放线杆菌；多杀性巴氏杆菌；副猪嗜血杆菌；复合PCR； PCR-ELISA PCR—ELISA检测方法的建立型 朱吕昌：App、Pm、Hps复合PCR检测方法以及App ofa