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特异性抗体的制备 第一节免疫原的制备 一、颗粒性抗原的制备 1.细胞抗原的制备： A 新鲜血经无菌NS洗涤3次，取压积红细胞并配制成2~5%,直接进行注射免疫。 B 新鲜血+抗凝剂— 4℃保存4W,免疫前取适量抗凝绵羊血，按A处理。 C 新鲜血去除纤维蛋白原后按B处理。 2.细菌抗原的制备：取标准菌株，接种， H抗原:取有动力的菌株液,用0.3~0.5%甲醛处理。 O抗原：菌液于100℃2.5h, Vi抗原：杀菌后，加入1%的氯化钙溶液。 3.虫卵也可作为抗原，例如日本血吸虫卵悬液。 4.组织细胞粗抗原：所用的组织必须是新鲜或处理后低温(-40 ℃)保存的。器官或组织材料得到后立即去除表面的包膜或结缔组织及大血管，用无菌NS进行灌注、洗涤至没有残血、污物，在冷浴中将组织剪成小块后粉碎(匀浆)/消化。粉碎方法有两种，一是高速组织捣碎机法：将组织+NS装入捣碎机筒中，开机即可，注意要高速(1万rmp)，间断(每次30秒~1min)进行，时间过长会导致产热，破坏抗原。另一种是研磨法(有时加入洗过的海沙使研磨更有效)。匀浆液经2~3千rmp离心，沉淀中含大量的组织细胞和碎片，上清液可提取可溶性抗原。消化是用胃蛋白酶或胰酶，通过酶解将细胞间质消化，获得游离单个细胞。 二、可溶性抗原的制备 1.细胞破碎：细胞可溶性抗原可分为：细胞膜蛋白抗原、细胞浆抗原、细胞核及核膜抗原。三种抗原的制备均需细胞破碎，细胞破碎有如下方法： A 反复冻融法：置-15~-20 ℃冻结，然后缓慢融化，反复2次，大部分细胞因胞内冰晶的形成和溶剂浓度的突然改变而被融破。此法适用于组织细胞，对微生物的细胞作用较差。 B 冷热交替法：将材料投入沸水中，90 ℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中。在细菌或病毒中提取蛋白质及核酸可用此法。 C 超声波破碎法：是利用超声波的机械振动而使细胞破碎的方法。注意避免长期超声产热。微生物和组织细胞破碎多用此法，但真菌厚膜孢子则较难打破。 D 酶处理法：酶在一定的条件下能消化细菌和细胞。例如在碱性(pH8.0)下，溶菌酶可专一破坏G+菌细胞壁。此法适用于多种微生物。 E 表面活性剂处理：在一定的条件下，表面活性剂能与细胞膜脂蛋白形成微泡，使膜的通透性发生改变而使细胞破碎。提取核酸时常用此法。 F 自溶法：利用组织和微生物的自身酶系，在一定条件下使细胞溶解。 2. 蛋白质抗原的制备：破碎的细胞按一定要求纯化，可获得不同成分的抗原。蛋白质抗原的制备可采用如下几种方式进行纯化： ⑴超速离心法：利用各抗原在梯度液中沉降速度不同，离心后使具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度的梯度层内，达到区带分离的目的。这是分离亚细胞部分和蛋白质大分子的有效手段。 ⑵ 选择性沉淀：是采用各种沉淀剂或改变条件使抗原成分沉淀而达到分离的目的。 A 核酸除去法:用DNA/RNA酶降解或用氯化锰/硫酸鱼精蛋白/链霉素作沉淀剂去除核酸。 B 盐析沉淀法：用不同饱和度的硫酸铵或硫酸钠，可将组织溶液分成若干组分。最常用的盐析剂为 33~50%的硫酸铵。例如:用40、35、33%的硫酸铵分次提取或用20%硫酸钠提取，即可获得丙种球蛋白(含IgG 95%以上) 。 C 有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度降低而沉淀，有些有机溶剂能破坏蛋白质的水化膜而使蛋白质沉淀，例Cohn地温酒精可将血浆蛋白分为五组。IgG属CohnⅢ。 D 其它沉淀剂：常用聚乙二醇(PEG)和硫酸葡聚糖。PEG浓度3~4%可沉淀IC，6~7%沉淀IgM，8~12%沉淀IgG,12~15%沉淀其它球蛋白，25%则沉淀白蛋白。按此原理设计了快速浊度测定法和IC的测定。 ⑶凝胶层析法：利用凝胶的多孔网状结构，大分子在凝胶颗粒间很快通过，小分子进入网孔，难于洗脱，将抗原分为大、中、小三种。属区带分离法。 ⑷离子交换层析：利用带离子基团的纤维或凝胶，吸附带相反电荷的抗原。 ⑸亲和层析：利用生物学分子间所具有的专一亲和性而设计的层析方法。Ag-Ab, 激素-受体，酶-酶配体，酶蛋白-辅酶。 3.核酸抗原的制备：细胞破碎液去除蛋白质(常用酚和氯仿抽提)后，用沉淀剂(常用乙醇)沉淀核酸。 4.脂多糖抗原的制备：苯酚提取法。 5.Ig片段的制备：酶裂解法—Fc、Fab 氧化/还原法：轻、重链。 6.纯化抗原的鉴定： A 含量测定:生化(双缩脲法)测蛋白质含量。 B 纯度及分子量鉴定：凝胶层析+电泳 免疫活性鉴定：双扩，对流免疫电泳。 三、半抗原免疫原的制备：利用某些功能 团将半抗原连接到载体上。 1.载体的选择： A 蛋白质:人/牛/兔