抑制消减杂交的原理及应用..pptVIP

抑制消减杂交的原理及应用 尚 立 娜 主 要 内 容 抑制消减杂交的定义 抑制消减杂交的原理 抑制性消减杂交技术的定义： 是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术.其原理是以杂交二级动力学和抑制性PCR反应为基础的cDNA消减杂交技术.通过合成两个不同的接头，连接于测试cDNA片段的5’末端，达到选择性扩增差异性表达的cDNA片段，抑制非目的cDNA的扩增.该技术与其他消减杂交技术相比 假阳性率低、敏感性高、效率高等优点而得到广泛应用. 抑制消减杂交的原理 杂交二级动力学原理：即丰度高的单链DNA在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，从而使原来在丰度上有差别的单链DNA相对含量达到基本一致。 抑制PCR原理：利用链内退火优于链间退火的特点，使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法作为模板与引物配对从而选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。 巢式PCR反应：巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物，结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异性 抑制消减杂交的原理 抑制消减杂交的实验过程 杂交双方为tester和driver ,tester含有要寻找的差异表达基因 合成ds cDNA:提取待比较的两组细胞的mRNA，利用3‘端引物将mRNA反转录为cDNA，根据真核生物mRNA序列3端具有poly A结构的特点，合成3端引物.反转录体系中要加入T4 DNA聚合酶以产生平头cDNA 。 tester准备:产生平头ds cDNA后，用Rsa I或Hae Ⅲ限制性内切酶将ds cDNA酶切成短片段，将tester cDNA分为两组，在T4连接酶的作用下分别在cDNA的5‘端连上两个不同的寡聚核苷酸接头(接头1和接头2).接头1和接头2分别是具有一段反向末端重复序列的寡核苷酸序列，以利于以后的选择性扩增。 抑制消减杂交的实验过程 driver准备:对于driver的ds cDNA只需经Rsa I或HacⅢ限制性内切酶酶切成短片段，而不需添加接头。 消减杂交:分别向两个tester样品中加入过量的driver cDNA，于杂交缓冲液中进行杂交反应。第一轮杂交反应完毕后，将两个tester样品混合，再加入过量变性的driver cDNA继续杂交反应。获得作为PCR扩增模板的差异表达序列。 PCR反应:杂交产物中两端连有不同接头的片段就是所寻找的差异表达基因。经补平末端后进行巢式PCR扩增以获得所需要的差异表达基因。 抑制消减杂交的实验过程 消减文库的克隆:经巢式PCR扩增得到所需要的差异表达基因后，利用TA克隆法将差异表达基因转化感受态大肠杆菌，根据蓝白斑筛选原理，筛选出转化成功的阳性菌落。最后根据插入片段的两端接头引物进行巢式PCR反应对插入片段进行特异性扩增。 抑制消减杂交的实验过程 ※ TA克隆构建原理： TA克隆系统由Invitrogen公司发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。 抑制消减杂交的实验过程 ※蓝白斑筛选原理： 大肠杆菌（ β-半乳糖苷酶缺陷型菌株）β-半乳糖苷酶可分成2部分即α肽段和C-段。α肽段的基因位于载体上并含有不影响其ORF（open reading ）的多克隆位点（MCS），而C-段的基因位于工程菌E. coli DH5α上。二者在同一菌株中表达时，菌株中的C-段与载体上的α肽段互补而具有酶活性，能将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。在MCS上插入新基因将会改变其ORF而使得载体上的α肽段不能与菌株中的C-段互补而不能将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝而产生白斑。选择转入的阳性克隆即选择白斑。 抑制消减杂交的实验过程 抑制消减杂交的实验过程 分子杂交 定义：确定单链核酸碱基序列的技术。其基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸（叫做探针）间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。这种技术可在DNA与DNA，RNA与RNA，或DNA与