番茄花药和小孢离体培养及转化雄性不育基因Barnase的研究.pdf

摘要 番茄(Lycopersicon esculentum Mill) 属于茄科番茄属，在世界各地广泛栽培，仅采用常规 育种手段选育番茄新品种，进展缓慢，花药培养和游离小孢子培养技术可以获得纯系，有助 于提高育种效率。同时，番茄是自花授粉作物，杂种优势十分明显，番茄雄性不育的研究对 其杂交育种非常重要。本文对番茄花药培养与游离小孢子培养影响因素进行了研究，通过花 药培养从‘里格尔 87-5’、‘石番9 号’、‘厚皮毛粉’中获得花粉植株；首次通过游离小孢子 培养从‘里格尔87-5’、‘金冠’、‘钻石’和‘厚皮毛粉’获得了大量的球型胚、心型胚。同 时，采用农杆菌介导法对烟草和番茄进行遗传转化，共获得25 株转Barnase 基因烟草和20 株转Barnase 基因番茄，并对转基因植株不育性生物学特征进行观察。具体结果如下： 1.建立了番茄花药愈伤组织诱导及植株再生的实验体系。本研究以6 个番茄品种的花药 为材料，研究了番茄花药胚胎发生与植株再生。研究表明基因型是番茄花药培养影响的决定 因素，不同基因型的愈伤组织诱导率明显不同；培养基中加入马铃薯汁、活性炭，6 个品种 的愈伤组织平均诱导率较对照分别降低了35.14%、95.48%；培养基中添加 1.0mg/L 的2 ， 4-D 和0.5mg/L 的KT ，‘里格尔87-5’和‘石番9 号’的诱导率都达最高；培养基中加入 30g/L 的蔗糖，‘里格尔87-5’的愈伤组织诱导率达20.24% ；培养基中加入10µmol/L 的硝 酸银，花药组织褐化率较对照降低了 70.59% 。番茄花药愈伤组织在 MS + ZT1.5mg/L+ IAA0.2mg/L 培养基上，不定芽诱导率高达40% ，此配方是番茄花药愈伤组织再分化成不定 芽的较优配方；在不定芽分化的培养基中加入2mg/L 的三十烷醇，可以提高不定芽的质量 及其分化率，显著提高了有效芽百分比；当不定芽长至 3-4cm 大小时，接入 1/2MS+2.0mg/LIBA 进行诱导生根，获得了番茄花粉植株。 2.番茄小孢子游离培养获得胚状体的研究。本实验采用两种不同方式的小孢子分离和 培养系统，WM 技术和SMC 技术。结果表明，WM 技术是番茄小孢子分离和培养的较优技 术体系。SMC 技术较WM 技术相比，‘里格尔87-5’和‘金冠’的胚产量分别降低了53.56%、 49.86% 。不同基因型的胚胎发生能力差异很大。本实验的3 个番茄品种在相同培养条件下， 小孢子胚产量从高到低的依次为：‘里格尔87-5’、‘金冠’、‘钻石’、‘厚皮毛粉’、‘002 ’。 其中，‘里格尔87-5’、‘金冠’和’钻石’较易形成胚状体，而在同一培养条件下，‘002 ’ 的胚产量仅有0.13 个，不易产生胚状体。在番茄小孢子游离培养过程中，加入番茄的未成 熟子房，5 个品种的小孢子胚产量都明显高于对照。 3.转化雄性不育 Barnase 基因烟草、番茄植株的获得。通过冻融法转化根癌农杆菌 LB4404 ，获得转Barnase 基因烟草和转Barnase 基因番茄。转Barnase 基因烟草和转Barnase 基因番茄经卡那霉素筛选，PCR ，RT-PCR 检测，表明Barnase 基因已整合到烟草和番茄基 因组中，并且能在植物中正常转录和表达。花器形态结构观察发现，转Barnase 基因烟草的 花丝明显缩短，花药扁平，经压片检查没有正常的花粉粒。转Barnase 基因烟草不能结实。 关键词：番茄，花药，小孢子，雄性不育，Barnase 基因 论文类型：B (应用基础研究) I Abstract Tomato (Lycopersicon esculentum Mill) belonged to Solanaceae Lycopersicon,widely cultivated throughout the world. However,progress in breeding new varieties only by conventional breeding had been slowed.