牡蛎（Crasostrea gigas）胰蛋白酶抑制剂的制备及其抗肿瘤活性的研究.pdf

牡蛎(Crassostreagigas)胰蛋白酶抑制剂 的制备及其抗肿瘤活性的研究 摘要 inhibitor， 本论文较系统地研究了牡蛎胰蛋白酶抑制剂(oystertrypsin OTI)的制备、分离纯化方法及其部分性质和抗肿瘤活性，为进一步探讨胰蛋白酶 抑制剂结构与功能间的关系提供了基础数据，也为抗肿瘤药物的开发提供了一个 新途径。 本文包括以下6个部分研究内容： 1．利用胰蛋白酶对底物BAEE的催化水解产物在波长253nIIl处有紫外吸收的 原理，建立了胰蛋白酶抑制活性的测定方法。以抑制率为50％时的抑制比活力 即IUM值，作为分离纯化时的活性筛选指标。 2．以热变性沉淀法和两次硫酸铵沉淀法处理牡蛎原料，冷冻干燥得到OTI粗 品，得率为17．98％，蛋白含量为56．51％，IUM值为6．58U／mg。此法简单可行、 成本低廉、安全性高。 G-75凝胶层析得到两个吸收峰，第一个峰A1峰有抑 3．oTI粗品经Sephadex 制活性，其IUM值为47．43U／mg。A1峰经胰蛋白酶一Sepharose4B亲和层析只得 到一个结合峰AIBl峰，其IUl；6值为270．74U／rag。在进行亲和层析之前，需要成 4B填料干粉相偶联。将AIBI峰用 功地将胰蛋白酶与溴化氰活化的Sepharose SephadexG-15凝胶层析脱盐，得到两个吸收峰，第二个峰AIBIC2峰有抑制活性， 其I堋值为299．54u／略。收集A181C2蜂，浓缩冻干，得到制备的OTI冻千粉。 粗品经过三步的分离纯化后，纯化倍数达到45．52，活性回收率为19．94％． 生长作用。同时以抗肿瘤药物5一氟尿嘧啶作为药物对照。结果表明，OTI对两种 肿瘤细胞生长都有一定的抑制作用，抑制率分别为20．78±2．37％和20．68+ 2．14％。同时，OTI对人肺腺癌A549细胞生长的抑制作用要高于对人宫颈癌Hela 细胞的生长抑制作用，且抑制率都为同剂量抗肿瘤药物5一氟尿嘧啶的50％左右。 5．采用高效反相液相色谱法纯化出011的抗肿瘤活性成分。先用c1E半制备 柱纯化，得到两个吸收峰，第二个峰Y2峰有抑制活性-其IUM值为373．31U／mg。 将Y2峰用c。B分析柱继续纯化并鉴定纯度，只洗脱出一个吸收峰Y2F峰，其IUM 值为380．84U／mg。分析柱的单峰说明，Y2F峰具有较高的纯度和活性，因此将其 作为OTI的抗肿瘤活性成分，命名为oTI^。 6．对OTIA的部分性质进行测定。OTIA具有很好的熟稳定性，在20一1009C的 2．0一 温度范围内都有胰蛋白酶抑制活性；OTIA也具有很好的pH稳定性，在pH 12．G的范围内都有胰蛋白酶抑卷4活性． kDa．OTIA对 采用高效排阻液相色谱法(HPSEC)测得OTIA的分子量是5．036 膑蛋白酶的摩尔抑制比近似为1；2，推断其为双头抑制剂，属于Bowman—Birk类 抑制剂。 的米氏常数砌值为l。211 n 因此。OTIA是抑制活力较强的竞争型胰蛋白酶抑制剡． OTIA含有9种氨基酸，’氮基酸残基数为40。其中，谷氨酸、丙氨酸和半胱 氨酸三种氨基酸约占71．20％，仅半胱氨酸就占35．93％。由氨基酸组成可以确定 OTIA为酸性胰蛋白酶搀制剂． 关键词：牡蛎：胰蛋白酶：抑制；分离纯化：肿瘤 on and Study characterizatiOn preparationpartiaI of i i nhibi