牡蛎锌离子结合性肽的分离纯化及其促锌吸收效果研究.pdf

谨以此论文献给我尊敬的导师刘尊英副教授和水产 品高值化利用实验室。 陈达 牡蛎锌离子结合活性肽的分离纯化及其促锌 吸收效果研究 牡蛎锌离子结合活性肽的分离纯化及其促锌吸收效果研究 摘 要 锌作为重要的矿质元素之一对于维持人体的新陈代谢必不可少，但缺锌症状 较为常见。目前市场上存在许多补锌产品，其安全性和生物利用率并不高。许多 研究证明了肽具有促进矿质元素吸收的能力，作为新型的矿质离子补充剂，肽- 锌复合物的构效关系及其作用机理尚不明确，限制了对其进行研究与开发利用。 因此，本研究以太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）为原料，采用生物酶解技术制 备锌离子结合活性肽，并对其进行分离纯化，解析其结构特征，并通过动物实验， 探讨肽-锌复合物的补锌效果，阐述其生物利用的可能机理。研究内容主要包括： 1. 牡蛎锌离子结合活性肽的酶解与反应条件优化。以锌离子结合能力和蛋 白回收率为指标，对六种商业蛋白酶及其复合酶酶解方式进行筛选优化，确定胃 蛋白酶为最佳水解酶；在此基础上对胃蛋白酶酶解过程中的水解度和锌离子结合 能力进行研究，发现当水解时间为 150 min 时，水解度和锌离子结合能力均达到 最大值，分别为24.44%和 5.36 μg/mg；采用单因素实验的方法，对牡蛎酶解物 与锌盐反应过程中的 pH，多肽蛋白 （配体）浓度，蛋白与锌盐的质量比，反应 的温度和反应时间进行分析，得出多肽与锌盐反应的最适条件为：pH 6.5 ，肽浓 度 4%，肽与锌盐的质量比 3:1 ，反应温度40 C ，反应时间 30 min ；通过测定胃 蛋白酶酶解液中不同组分含量和锌离子结合活性证实了5 kDa 组分占优势，其 含量为 88.11%，锌离子结合能力为 5.21-5.30 μg/mg。 2. 牡蛎锌离子结合活性肽的分离纯化与结构解析。通过固定化金属亲和层 析（IMAC-Zn2+ ）筛选出酶解物中锌离子结合能力强的组分F ，后用反相高效液 3 相色谱 （RP-HPLC ）将该组分作进一步分离并用液质联用（LC-MS/MS ）鉴定出 目的组分 （F32 ）序列为 HLRQEEKEEVTVGSLK （从 N 端到 C 端），分子量为 1882.0 Da ，经测定F32 的锌离子结合能力为 6.56 μg/mg，显著高于粗酶解液 （P0.05 ）；体外模拟胃肠道消化实验显示该序列的活性能够绝大部分的保留， 约为原始的 85.98%；紫外和红外光谱中发现了锌离子结合前后肽谱图中出现了 特征吸收峰的消失、减弱和迁移，这些均证实了多肽中的氨基氮原子和羧基中的 氧原子是锌离子结合的主要位点。 3. 牡蛎锌离子结合活性肽的补锌效果研究。对缺锌大鼠补充不同形式的锌 盐，观察其生长状况，发现缺锌组大鼠 4 周的体重增重率仅为 17.3%，远远低于 补锌组，而牡蛎肽-锌复合物和 CPP-锌复合物组的效果优于无机锌组，说明缺锌 会影响大鼠的生长；不同组织和器官中的锌含量同样显示牡蛎肽-锌复合物组和 CPP-锌复合物组结果相似，且高于无机锌组和缺锌组；表观吸收率的实验结果 中无机锌组为78.62%，而牡蛎肽-锌复合物和 CPP-锌复合物组分别为 84.02%和 85.40%，明显高于前者 （P0.05 ），表明牡蛎肽具有较好促进锌吸收的效果，但 其转运机制、生物利用途径及详细的吸收机理还需要进一步探讨。 关键词：牡蛎；活性肽；锌；分离纯化 Promotion of zinc absorption and isolation of a zinc-binding peptide using oyster protein hydrolysate Abstract As one of the most important micronutrients, zinc is involved in multiple functions related to the norm