牛乳金黄色葡萄菌生物被膜多糖的提取及其免疫原性的研究.pdf

摘 要 引起奶牛乳房炎 （cow mastitis ）、食物中毒以及临床感染的关键致病菌之一是金 黄色葡萄球菌，长期以来，对该病原菌感染的治疗手段主要以抗生素为主，然而，抗 生素大量持久的使用会导致细菌耐药菌株的形成，使预防和治疗难度不断增大。牛乳 金黄色葡萄球菌耐药菌株的存在也同样给食品安全带来巨大隐患，因此，以金黄色葡 萄球菌耐药菌株生物被膜免疫原性为切入点开展研究，为探索乳源金黄色葡萄球菌耐 药菌株的快速检测方法提供依据。 本试验以牛乳中金黄色葡萄球菌耐药菌株为目标菌，研究在 TSB 液体培养基中添 加不同的营养成分，通过活菌计数观察生物被膜的生长情况，从而对金黄色葡萄球菌 生物被摸的培养条件进行优化。经过培养的成熟的金黄色葡萄球菌生物被膜，采用超 声波法振荡洗脱已培养好的生物被膜，用无水乙醇沉淀法对生物被膜多糖进行了提 取，并采用加酶法、过葡聚糖纤维素柱层析法和超滤浓缩法对提取的生物被膜粗多糖 进行进一步纯化，同时用常规法（苯酚-硫酸法）测定其中多糖的含量。最后，用经 过纯化好的生物被膜多糖来免疫 BalB/c 小鼠，同时采用间接 ELISA 法检测血清抗体 效价。 试验结果表明，金黄色葡萄球菌生物被膜在加有 1％乳糖、2 ％NaCl 和 6 ％胎牛 血清的液体 TSB 培养基中生长力最强。用此条件培养并提取和纯化的生物被膜多糖， 其粗糖的纯度为 13.99﹪，精制多糖的纯度为 69.05 ﹪。核酸的含量为 0.1109mg/mL ， 蛋白质的含量为 0.0247mg/mL 。用经过纯化的生物被膜多糖免疫 BalB/c 小白鼠，生 理盐水注射组作为阴性对照，测定结果显示，纯化的生物被膜多糖没产生生物被膜多 糖特异性抗体，没有刺激动物机体产生免疫应答，只是随着免疫次数的增加，OD 值 会逐渐增高，原浓度组在三免后一周出现了最大值，最大时达到了 0.85 。初步判定生 物被膜多糖这类小分子物质是半抗原物质，是非 T 细胞依赖性抗原，作用于动物机体 后未出现明显的免疫应答。 关键词：金黄色葡萄球菌；耐药菌株；生物被膜多糖；纯化；免疫原性 Study the Extraction of BP and the Immunogenicity of Conjugate in BP from Staphylococcus Aureus Abstract One of the key pathogenic bacteria causing cow mastitis, clinical infection and food poisoning is staphylococcus aureus, a long time, the pathogen infection treatment mainly antibiotics, however, a large number of persistent antibiotic use can lead to the formation of bacteria resistant strains, the prevention and treatment of increased difficulty. Milk the presence of staphylococcus aureus resistant strains can also lead to huge hidden danger to food safety, therefore, to staphylococcus aureus resistant strain biofilm immunogenicity as the breakthrough point to carry out the research, to explore ruyuan staphylococcus aureus, provides the reference for the rapid detection methods of drug resistant strains. This test is in order to take the staphylococcus aureus in milk resistant strains for target bacteria,