库尔勒香梨苹果痘病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达.pdf

摘 要 我国商业果园果树主栽品种携带病毒十分普遍。在果树种植面积不断扩大和栽培时 间延长的同时，病毒危害越来越重，因此研究人员、果树生产与经营者加大了对病毒的 重视。苹果茎痘病毒（apple stem pitting virus, ASPV）为Foveaviris （Martelli G.P 等， 1998）的代表种，该病毒寄主范围和分布较广，能侵染多种果树。早期曾将梨茎痘病、 梨黄化病、梨红色斑驳病、梨脉黄病、梨石痘病、苹果茎痘病的病源归为不同的病毒种 （吴雅琴等，2000 ），但Jelkmann 等证实以上几种病害均由ASPV 所引起。ASPV 因其 寄主及地理分布不同而存在差异，目前已分离多个分离物。现对苹果茎痘病毒外壳蛋白 新疆库尔勒香梨分离物进行克隆，测序，序列分析以及诱导该分离物原核表达，研究苹 果茎痘病毒的功能区域。 1.采集经RT-PCR 检测确定已带有苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus ，ASPV) 的 香梨一二年生的枝条为试验材料，根据GenBank 中的EU095327 序列设计合成引物，扩 增ORF5 外壳蛋白的核酸序列片段。将目的片段转入到克隆载体中，经酶切，测序证实 所得片段为目的片段，与MHczAp 、ASPV isolate24 、ASPV isolate38 分离物核苷酸同 源序列分别为81%-83%，氨基酸的同源率分别为70%-71% 。 2.酶切连接有目的片段的克隆载体，将目的片段纯化，转入表达载体pET-3a 中。挑 取阳性菌落，测序，证实该基因序列表达框正确。将连接目的基因片段的表达载体转入 大肠杆菌BL21 中，经过IPTG 诱导表达，在不同时间均获得了表达，且表达蛋白产物 的分子质量大小与预期值一致，并可被特异性抗体所识别。另外，该基因在BL21 的表 达具有时效性特点，1~3h 里表达量较高，4h 后重组蛋白表达量开始下降。预测ASPV CP 的蛋白相对分子质量为43.7kDa，与实验检测的重组蛋白相对分子质量基本一致。 本文将克隆与原核表达技术应用于新疆库尔勒香梨苹果茎痘病毒的研究，通过苹果 茎痘病毒载体构建和表达的研究，获得了苹果茎痘病毒新疆分离物，与国内外分离物进 行比较，为今后抗血清的制备提供了一定的依据 关 键 词：苹果茎痘病毒；新疆库尔勒香梨；外壳蛋白；克隆；原核表达； 论文类型：B （应用基础研究） I Abstract A lot of trees in commercial fruit yards are infected commonly by viruses in China. Along with the continual enlargement of planting area towards fruit trees and the extension of their planting time, harmness from the viruses is more and more obvious and more attentions are paid by scientists and researchers, producers and businessmen of fruit trees. Foveavirus is a novel genus of plant viruses, typified by apple stem pitting virus (ASPV). Apple stem pitting virus (ASPV) is widely spread in commercial apple cultivars which are symptomlessly infected. Pear ring pattern mosoic virus(PRPMV）, Pear vein yellow virus (PVYV ）, Apple stem grooving virus (ASGV) , and Apple stem pitt